Анализ морфологии Дендритные позвоночника в культуре нейронов ЦНС
Summary
Многочисленные недавние исследования выявили мутации в синаптические белки, связанные с мозговыми патологиями. Первичная культурный нейронов коры предлагаем большую гибкость при рассмотрении последствий этих заболеваний белков, связанных с морфологией на дендритных позвоночника и подвижности.
Abstract
Дендритные шипы сайтах большинства возбуждающих связей в мозгу, и образуют постсинаптические отсеке синапсов. Эти структуры представляют собой богатый актина и было показано, что весьма динамичным. В ответ на классической пластичности Хебба, а также neuromodulatory сигналов, дендритных шипиков может изменить форму и номер, который считается критическим для уточнения нейронных цепей и обработки и хранения информации в мозге. В дендритных шипиков, сложная сеть белков внеклеточного ссылку сигналов с актином cyctoskeleton позволяет контролировать морфологию дендритных позвоночника и номер. Нейропатологических исследования показали, что количество болезненных состояний, начиная от шизофрении расстройства аутистического спектра, дисплей ненормальные дендритные морфологии позвоночника или цифр. Кроме того, недавние генетические исследования выявили мутации во многих генах, которые кодируют белки синаптических, что приводит к предположениям, что эти белки могут способствовать аберрантных пластичности позвоночника, что, в частности, лежат в основе патофизиологии этих расстройств. С целью изучения потенциальной роли этих белков в контроле дендритных морфологии позвоночника / номер, использование культурных нейронов коры обладает рядом преимуществ. Во-первых, эта система позволяет изображений с высоким разрешением дендритных шипиков в основной клетки, а также замедленная съемка живых клеток. Во-вторых, эта система в пробирке позволяет легко манипулировать функции белка путем экспрессии мутантных белков, нокдаун по конструкции shRNA или фармакологические методы лечения. Эти методы позволяют исследователям, чтобы начать анализировать роль болезней связанных белков и предсказать, как мутации этих белков может функционировать в естественных условиях.
Protocol
Discussion
Методы, описанные выше, для детального количественного анализа морфологии дендритных позвоночника, линейной плотности и подвижности в фиксированный или жить первичных корковых нейронов сосредоточены на понимании последствий постсинаптических механизмов, которые могут способствов…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Келли Джонс тщательного редактирования. Эта работа была поддержана NIH грант R01MH 071316, Ассоциация Альцгеймера, Национальный Альянс по исследованиям в области шизофрении и депрессии (NARSAD) и Национальный альянс для изучения аутизма (NAAR) (PP); Американской ассоциации сердца Докторантура стипендий (DPS), американский Ассоциация Сердца Predoctoral стипендий (KMW).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| 18 mm round Cover glass No. 1.5 | Warner Instruments | 64-0714 (CS-18R15) | |
| 22 mm square Cover glass No. 1.5 | Warner Instruments | 64-0721 (CS-22S15) | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P-0899 | MW 70~150 Kda |
| Neurobasal Media | Invitrogen | 21103049 | |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | |
| Glutamine | Invitrogen | 21051024 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140148 | |
| D,L-APV (AP-5) | Ascent Scientific | Asc-004 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| DMEM | Invitrogen | 11965092 | |
| HEPES | MediaTech Cellgro | 25-060-C 1 | 1M, pH 7 |
| Formaldehyde Solution | EMD Chemicals | FX0415-5 | 36%, Histology grade |
| Normal Goats Serum | VWR | 100188-514 | Jackson Immunoresearch Labs |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | AC21568-2500 | Acros Organics |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) highly cross-adsorbed | Invitrogen | A-11029 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) *highly cross-adsorbed* | Invitrogen | A-11034 | |
| ProLong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36934 | Special Packaging |
| Enclosed imaging stage chamber | Warner | RC-30HV | |
| Temperature controller unit | Warner | TC-344B | |
| MetaMorph | Universal Imaging |
References
- Banker, G., Goslin, K. Developments in neuronal cell culture. Nature. 336, 185-186 (1988).
- Xie, Z. Kalirin-7 controls activity-dependent structural and functional plasticity of dendritic spines. Neuron. 56, 640-656 (2007).
- Spear, L. Modeling adolescent development and alcohol use in animals. Alcohol Res Health. 24, 115-123 (2000).
- Srivastava, D. P., Woolfrey, K. M., Liu, F., Brandon, N. J., Penzes, P. Estrogen receptor ss activity modulates synaptic signaling and structure. J Neurosci. 30, 13454-13460 (2010).
- Srivastava, D. P. Rapid enhancement of two-step wiring plasticity by estrogen and NMDA receptor activity. Proc Natl Acad Sci USA. 105, 14650-14655 (2008).
- Woolfrey, K. M. Epac2 induces synapse remodeling and depression and its disease-associated forms alter spines. Nat Neurosci. 12, 1275-1284 (2009).
- Allison, D. W., Gelfand, V. I., Spector, I., Craig, A. M. Role of actin in anchoring postsynaptic receptors in cultured hippocampal neurons: differential attachment of NMDA versus AMPA receptors. J Neurosci. 18, 2423-2436 (1998).
- Harms, K. J., Tovar, K. R., Craig, A. M. Synapse-specific regulation of AMPA receptor subunit composition by activity. J Neurosci. 25, 6379-6388 (2005).
- Xie, Z., Huganir, R. L., Penzes, P. Activity-dependent dendritic spine structural plasticity is regulated by small GTPase Rap1 and its target AF-6. Neuron. 48, 605-618 (2005).
- Jones, K. A. Rapid modulation of spine morphology by the 5-HT2A serotonin receptor through kalirin-7 signaling. Proc Natl Acad Sci USA. 106, 19575-19580 (1957).
- Dunaevsky, A., Tashiro, A., Majewska, A., Mason, C., Yuste, R. Developmental regulation of spine motility in the mammalian central nervous system. Proc Natl Acad Sci USA. 96, 13438-13443 (1999).
- Lichtman, J. W., Conchello, J. A. Fluorescence microscopy. Nat Methods. 2, 910-919 (2005).
- Svoboda, K. Do spines and dendrites distribute dye evenly. Trends Neurosci. 27, 445-446 (2004).
