Analisi di Morfologia spine dendritiche in colture di neuroni del SNC
Summary
Numerosi studi recenti hanno identificato mutazioni di proteine sinaptiche associate a patologie cerebrali. Colture di neuroni corticali primarie offrono una grande flessibilità in sede di esame gli effetti di queste malattie proteine associate spine dendritiche sulla morfologia e la motilità.
Abstract
Spine dendritiche sono i siti della maggior parte delle connessioni eccitatorie all'interno del cervello, e la forma post-sinaptica vano di sinapsi. Queste strutture sono ricchi di actina e hanno dimostrato di essere altamente dinamica. In risposta alla classica plasticità Hebbian così come i segnali neuromodulatori, spine dendritiche possono cambiare forma e numero, che è pensato per essere critica per la raffinatezza dei circuiti neurali e della trasformazione e conservazione delle informazioni all'interno del cervello. All'interno di spine dendritiche, una complessa rete di proteine collegamento segnali extracellulari con il cyctoskeleton actina permettendo il controllo della morfologia e il numero di spine dendritiche. Gli studi neuropatologici hanno dimostrato che un certo numero di stati patologici, che vanno dalla schizofrenia ai disturbi dello spettro autistico, display anomalie morfologiche dendritiche colonna vertebrale o numeri. Inoltre, recenti studi genetici hanno identificato mutazioni in numerosi geni che codificano proteine sinaptiche, portando a suggestioni che queste proteine possono contribuire alla plasticità della colonna vertebrale aberrante che, in parte, alla base della fisiopatologia di questi disturbi. Per studiare il potenziale ruolo di queste proteine nel controllo delle morfologie spine dendritiche / numero, l'uso di colture di neuroni corticali offre diversi vantaggi. In primo luogo, questo sistema permette di imaging ad alta risoluzione delle spine dendritiche in cellule fisse e time-lapse imaging di cellule vive. In secondo luogo, questo sistema in vitro permette una facile manipolazione della funzione della proteina da parte espressione di proteine mutanti, l'abbattimento da costrutti shRNA, o trattamenti farmacologici. Queste tecniche permettono ai ricercatori di iniziare a sezionare il ruolo di proteine associate alla malattia e per prevedere come le mutazioni di queste proteine possono funzionare in vivo.
Protocol
Discussion
Le tecniche descritte sopra per la dettagliata analisi quantitativa della morfologia spine dendritiche, densità lineare e la motilità sia in neuroni primari fissa o vivere corticali sono focalizzati sulla comprensione degli effetti di post-sinaptico meccanismi che possono contribuire alla neuropatologie. Un approccio simile può essere utilizzato per quantificare la morfologia e la motilità della colonna vertebrale in qualsiasi neuroni spinosi, tra cui piramidali dell'ippocampo, Purkinje, o neuroni spinosi di med…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Kelly Jones per l'editing accurato. Questo lavoro è stato sostenuto da NIH concedere R01MH 071316, l'Alzheimer Association, l'Alleanza Nazionale per la Ricerca sulla Schizofrenia e Depressione (NARSAD), e l'Alleanza Nazionale per la Ricerca Autismo (NAAR) (PP); American Heart Association borsa di studio post-dottorato (DPS); americano Heart Association Fellowship Predoctoral (KMW).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| 18 mm round Cover glass No. 1.5 | Warner Instruments | 64-0714 (CS-18R15) | |
| 22 mm square Cover glass No. 1.5 | Warner Instruments | 64-0721 (CS-22S15) | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P-0899 | MW 70~150 Kda |
| Neurobasal Media | Invitrogen | 21103049 | |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | |
| Glutamine | Invitrogen | 21051024 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140148 | |
| D,L-APV (AP-5) | Ascent Scientific | Asc-004 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| DMEM | Invitrogen | 11965092 | |
| HEPES | MediaTech Cellgro | 25-060-C 1 | 1M, pH 7 |
| Formaldehyde Solution | EMD Chemicals | FX0415-5 | 36%, Histology grade |
| Normal Goats Serum | VWR | 100188-514 | Jackson Immunoresearch Labs |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | AC21568-2500 | Acros Organics |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) highly cross-adsorbed | Invitrogen | A-11029 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) *highly cross-adsorbed* | Invitrogen | A-11034 | |
| ProLong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36934 | Special Packaging |
| Enclosed imaging stage chamber | Warner | RC-30HV | |
| Temperature controller unit | Warner | TC-344B | |
| MetaMorph | Universal Imaging |
References
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