Analys av Dendritiska Spine Morfologi i odlade CNS Neuroner
Summary
Många nyare studier har identifierat mutationer i synaptiska proteiner associerade med hjärnan sjukdomar. Primär odlade kortikala neuroner ger stor flexibilitet för att undersöka effekterna av dessa sjukdomar associerade proteiner på dendritiska ryggraden morfologi och motilitet.
Abstract
Dendritutskotten är platsen för de flesta av excitatoriska kopplingar i hjärnan, och utgör den postsynaptiska fack av synapser. Dessa strukturer är rika på aktin och har visat sig vara mycket dynamisk. Som svar på klassiska Hebbianskt plasticitet samt signaler neuromodulatory kan Dendritutskotten ändra form och antal, som tros vara avgörande för förädling av nervbanor och bearbetning och lagring av information i hjärnan. Inom Dendritutskotten, ett komplext nätverk av proteiner länk extracellulära signaler med aktin cyctoskeleton möjliggör styrning av dendritiska ryggraden morfologi och nummer. Neuropatologiska studier har visat att ett antal sjukdomstillstånd, allt från schizofreni till autismspektrumstörningar, visa onormala dendritiska ryggraden morfologi eller siffror. Dessutom har senare tids genetiska studier identifierades mutationer i flera gener som kodar synaptiska proteiner, vilket leder till förslag att dessa proteiner kan bidra till avvikande ryggraden plasticitet som delvis ligger till grund för patofysiologin vid dessa sjukdomar. För att studera vilken roll dessa proteiner i kontrollen av dendritiska ryggraden morfologier / nummer ger användningen av odlade kortikala neuroner flera fördelar. För det första kan detta system för högupplöst avbildning av Dendritutskotten i fasta celler samt tidsförlopp avbildning av levande celler. För det andra ger detta in vitro-system för enkel hantering av proteiners funktion genom uttryck av muterade proteiner, ÖVERVÄLDIGANDE av shRNA konstruerar eller farmakologisk behandling. Dessa tekniker tillåter forskare att börja dissekera betydelsen av sjukdomar associerade proteiner och att förutse hur mutationer av dessa proteiner kan fungera in vivo.
Protocol
Discussion
De tekniker som beskrivs ovan för en detaljerad kvantitativ analys av dendritiska ryggraden morfologi, linjär densitet och motilitet i antingen fast eller bor primära kortikala neuroner är fokuserade på att förstå effekterna av postsynaptiska mekanismer som kan bidra till neuropathologies. Ett liknande tillvägagångssätt kan användas för att kvantifiera ryggraden morfologi eller motilitet i någon taggig neuron, inklusive hippocampus pyramidal, Purkinje, eller medium nervceller taggiga.
<p class="jove_con…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Kelly Jones för noggrann redigering. Detta arbete stöddes av NIH bidrag R01MH 071.316, Alzheimers Association, National Alliance för forskning om schizofreni och depression (NARSAD) och National Alliance for Autism Research (naar) (PP), American Heart Association postdoktorsstipendium (DPS), amerikansk Heart Association Predoctoral Fellowship (KMW).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| 18 mm round Cover glass No. 1.5 | Warner Instruments | 64-0714 (CS-18R15) | |
| 22 mm square Cover glass No. 1.5 | Warner Instruments | 64-0721 (CS-22S15) | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P-0899 | MW 70~150 Kda |
| Neurobasal Media | Invitrogen | 21103049 | |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | |
| Glutamine | Invitrogen | 21051024 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140148 | |
| D,L-APV (AP-5) | Ascent Scientific | Asc-004 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| DMEM | Invitrogen | 11965092 | |
| HEPES | MediaTech Cellgro | 25-060-C 1 | 1M, pH 7 |
| Formaldehyde Solution | EMD Chemicals | FX0415-5 | 36%, Histology grade |
| Normal Goats Serum | VWR | 100188-514 | Jackson Immunoresearch Labs |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | AC21568-2500 | Acros Organics |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) highly cross-adsorbed | Invitrogen | A-11029 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) *highly cross-adsorbed* | Invitrogen | A-11034 | |
| ProLong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36934 | Special Packaging |
| Enclosed imaging stage chamber | Warner | RC-30HV | |
| Temperature controller unit | Warner | TC-344B | |
| MetaMorph | Universal Imaging |
References
- Banker, G., Goslin, K. Developments in neuronal cell culture. Nature. 336, 185-186 (1988).
- Xie, Z. Kalirin-7 controls activity-dependent structural and functional plasticity of dendritic spines. Neuron. 56, 640-656 (2007).
- Spear, L. Modeling adolescent development and alcohol use in animals. Alcohol Res Health. 24, 115-123 (2000).
- Srivastava, D. P., Woolfrey, K. M., Liu, F., Brandon, N. J., Penzes, P. Estrogen receptor ss activity modulates synaptic signaling and structure. J Neurosci. 30, 13454-13460 (2010).
- Srivastava, D. P. Rapid enhancement of two-step wiring plasticity by estrogen and NMDA receptor activity. Proc Natl Acad Sci USA. 105, 14650-14655 (2008).
- Woolfrey, K. M. Epac2 induces synapse remodeling and depression and its disease-associated forms alter spines. Nat Neurosci. 12, 1275-1284 (2009).
- Allison, D. W., Gelfand, V. I., Spector, I., Craig, A. M. Role of actin in anchoring postsynaptic receptors in cultured hippocampal neurons: differential attachment of NMDA versus AMPA receptors. J Neurosci. 18, 2423-2436 (1998).
- Harms, K. J., Tovar, K. R., Craig, A. M. Synapse-specific regulation of AMPA receptor subunit composition by activity. J Neurosci. 25, 6379-6388 (2005).
- Xie, Z., Huganir, R. L., Penzes, P. Activity-dependent dendritic spine structural plasticity is regulated by small GTPase Rap1 and its target AF-6. Neuron. 48, 605-618 (2005).
- Jones, K. A. Rapid modulation of spine morphology by the 5-HT2A serotonin receptor through kalirin-7 signaling. Proc Natl Acad Sci USA. 106, 19575-19580 (1957).
- Dunaevsky, A., Tashiro, A., Majewska, A., Mason, C., Yuste, R. Developmental regulation of spine motility in the mammalian central nervous system. Proc Natl Acad Sci USA. 96, 13438-13443 (1999).
- Lichtman, J. W., Conchello, J. A. Fluorescence microscopy. Nat Methods. 2, 910-919 (2005).
- Svoboda, K. Do spines and dendrites distribute dye evenly. Trends Neurosci. 27, 445-446 (2004).
