ReAsH / Flash etiquetado y análisis de imágenes de las proteínas en las células del sensor Tetracysteine
Summary
El biarsenical FlAsH tintes y ReAsH se unen específicamente a los motivos tetracysteine en proteínas y selectiva puede etiquetar las proteínas en células vivas. Recientemente, esta estrategia de etiquetado se ha utilizado para desarrollar sensores para diferentes conformaciones de las proteínas o los estados oligoméricos. Se describe el mecanismo de etiquetado y métodos para analizar cuantitativamente vinculante.
Abstract
Las proteínas fluorescentes y tintes son herramientas esenciales para el estudio de proteínas tráfico, localización y función en las células. Mientras que las proteínas fluorescentes como la proteína verde fluorescente (GFP) han sido ampliamente utilizados como socios de la fusión de las proteínas para hacer un seguimiento de las propiedades de una proteína de interés 1, los acontecimientos recientes más pequeñas etiquetas permiten nuevas funcionalidades de las proteínas que se examinarán en las células, como el cambio conformacional y proteínas de asociación 2, 3. Un sistema de etiqueta pequeña implica un motivo tetracysteine (CCXXCC) genéticamente insertado en una proteína diana, que se une a colorantes biarsenical, ReAsH (fluorescente de color rojo) y Flash (de color verde fluorescente), con una alta especificidad, incluso en las células vivas 2. El sistema de TC / biarsenical tinte ofrece mucho menos restricciones estéricas de la proteína de acogida de proteínas fluorescentes que ha permitido a varios nuevos métodos para medir el cambio en la conformación y las interacciones proteína-7.4. Recientemente hemos desarrollado una nueva aplicación de etiquetas de TC como sensores de oligomerización en células que expresan huntingtina mutante, que cuando mutan agregados en las neuronas en la enfermedad de Huntington 7. Huntingtina fue etiquetado con dos tintes fluorescentes, una una proteína fluorescente para seguir la localización de proteínas, y la segunda, una etiqueta de TC, que sólo vincula a los tintes biarsenical en monómeros. Por lo tanto, los cambios en la colocalización entre la proteína y la reactividad tinte biarsenical contenido habilitado oligómero submicroscópicas que se asigna espacio dentro de las células. Aquí se describe cómo etiquetar TC-etiquetados proteínas fusionadas a una proteína fluorescente (Cherry, las buenas prácticas agrarias o PPC) con flash o ReAsH en vivo las células de mamíferos y la forma de cuantificar la fluorescencia de dos colores (cereza / Flash, PPC / Flash o GFP / ReAsH combinaciones).
Protocol
Discussion
El enfoque de la localización de la etiqueta de proteínas con una proteína fluorescente y propiedades conformacionales con un tinte segunda ofrece un gran potencial para el mapeo en diferentes conformaciones de las proteínas se acumulan en las células y los eventos que cambian la dinámica de la conformación de la proteína. ReAsH / Flash se utilizó por primera vez como un sensor en el celular de plegamiento de las proteínas celulares de los mamíferos del ácido retinoico-proteína de unión I 4. En …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por becas de DMH y TDM (NHMRC subvenciones para proyectos). DMH es un compañero Grimwade, financiado por la Fundación Miegunyah.
Materials
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
|---|---|---|---|
| 8-well μ-slides | Ibidi | 80826 | We find these chamber slides to be particularly useful for culturing cells for imaging. |
| TC-FlAsH II In-cell Tetracysteine Tag Detection Kit *green fluorescence* *for live-cell imaging | Invitrogen | T34561 (FlAsH) or T34562 (ReAsH) | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution | Invitrogen | 14175-103 | |
| 2,3-Dimercapto-1-propanol | Sigma-Aldrich | D1129-5ML | |
| 1,2-Ethanedithiol | Sigma-Aldrich | 02390-25ML |
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