ReAsH / Flash Etiketleme ve Hücreler Tetracysteine Sensör Proteinlerin Görüntü Analizi
Summary
Flash ve ReAsH biarsenical boyalar özellikle proteinlerin tetracysteine motiflerine bağlanır ve seçici canlı hücrelerde protein etiketleyebilirsiniz. Son zamanlarda bu etiketleme stratejisi, farklı protein konformasyonlar veya oligomerik devletler için sensörler geliştirmek için kullanılır olmuştur. Biz etiketleme yaklaşımı tanımlar ve yöntemleri kantitatif bağlayıcı analiz etmek.
Abstract
Floresan proteinleri ve boyalar, hücrelerin protein kaçakçılığı, yerelleştirme ve fonksiyon çalışması için gerekli araçları vardır. Yeşil floresan proteininin (GFP) gibi floresan proteinleri yoğun proteinlere füzyon ortağı olarak küçük etiketleri konformasyonel değişikliği gibi hücrelerin incelenmesi gereken proteinlerin yeni işlevler sağlayan bir protein ilgi 1 özellikleri, son gelişmeleri takip etmek için kullanılmış olsa da ve protein dernek 2, 3. Bir küçük etiket sistemi genetik biarsenical boyalar bağlayan bir hedef protein, içine yerleştirilen bir tetracysteine motifi (CCXXCC) içerir ReAsH (kırmızı floresan) ve Flash (yeşil floresan), 2 canlı hücrelerinde bile yüksek özgüllüğü. TC / biarsenical boya sistemi, konformasyonel değişikliği ve protein-protein etkileşimleri 4-7 ölçmek için birçok yeni yaklaşımlar sağladı floresan proteinleri daha ana proteine daha az sterik kısıtlamalar sunmaktadır . Yakın zamanda hücrelerde mutant huntingtin ifade oligomerization, sensörler, bir roman gibi TC etiketleri uygulama geliştirdi Huntington hastalığı 7 nöronların agrega mutasyona uğramış. Huntingtin iki floresan boyalar, bir protein konumunu izlemek için floresan protein ve sadece monomerlerin biarsenical boyalar bağlayan ikinci bir TC etiketi ile etiketlenmiş. Bu nedenle, protein ve biarsenical boya reaktivitesi arasında ko değişiklikler hücre içinde mekansal eşlenebilir mikroskopik oligomer içerikler sağladı. Burada, Flash veya ReAsH canlı memeli hücrelerinde ve nasıl iki renkli floresan (Kiraz / Flash CFP / / Flash veya GFP ölçmek için bir floresan proteini (Kiraz, GFP veya CFP) erimiş TC etiketli proteinlerin nasıl etiketlemek için tarif ReAsH kombinasyonları).
Protocol
Discussion
Ikinci bir boya ile floresan protein ve konformasyonel özellikleri ile etiket protein lokalizasyon yaklaşımı farklı proteinlerin konformasyonlar hücreleri ve protein konformasyonu dinamiklerini değiştiren olaylar tahakkuk haritalama için çok potansiyel sunmaktadır. ReAsH / Flash ilk memeli hücresel retinoik asit bağlayıcı protein 4 protein katlanması için bir hücre sensörü olarak kullanılmıştır. Bu örnekte, bir TC etiketi bağlı Flash gelişeceğini formuna göre katlanmış şeklind…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma DMH ve TDM (NHMRC proje hibe) bağışları ile finanse edilmiştir. DMH Miegunyah Trust tarafından finanse edilen bir Grimwade Üyesi.
Materials
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
|---|---|---|---|
| 8-well μ-slides | Ibidi | 80826 | We find these chamber slides to be particularly useful for culturing cells for imaging. |
| TC-FlAsH II In-cell Tetracysteine Tag Detection Kit *green fluorescence* *for live-cell imaging | Invitrogen | T34561 (FlAsH) or T34562 (ReAsH) | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution | Invitrogen | 14175-103 | |
| 2,3-Dimercapto-1-propanol | Sigma-Aldrich | D1129-5ML | |
| 1,2-Ethanedithiol | Sigma-Aldrich | 02390-25ML |
References
- Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Ann. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).
- Griffin, B. A., Adams, S. R., Tsien, R. Y. Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells. Science. 281, 269-2672 (1998).
- Uttamapinant, C. A fluorophore ligase for site-specific protein labeling inside living cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 10914-10919 (2010).
- Ignatova, Z., Gierasch, L. M. Monitoring protein stability and aggregation in vivo by real-time fluorescent labeling. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 523-528 (2004).
- Coleman, B. M. Conformational detection of prion protein with biarsenical labeling and FlAsH fluorescence. Biochem. Biophys. Res. Commun. 380, 564-568 (2009).
- Luedtke, N. W., Dexter, R. J., Fried, D. B., Schepartz, A. Surveying polypeptide and protein domain conformation and association with FlASH and ReAsH. Nat. Chem. Biol. 3, 779-784 (2007).
- Ramdzan, Y. M. Conformation sensors that distinguish monomeric proteins from oligomers in live cells. Chem. Biol. 17, 371-379 (2010).
- Abramoff, M. a. g. e. l. h. a. e. s., PJ, S. J. R. a. m. Image processing with ImageJ. Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).
- Hearps, A. The biarsenical dye Lumio exhibits a reduced ability to specifically detect tetracysteine-containing proteins within live cells. J. Fluor. 17, 593-597 (2007).
- Adams, S. R. New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: Synthesis and biological applications. J. Am. Chem. Soc. 124, 6063-6076 (2002).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat. Meth. 2, 905-909 (2005).
