ReAsH / Flash märkning och bildanalys av proteiner Tetracysteine sensor i cellerna
Summary
Den biarsenical färgämnen Flash och ReAsH binder specifikt till tetracysteine motiv i proteiner och kan selektivt etikett proteiner i levande celler. Nyligen denna märkning strategi har använts för att utveckla sensorer för olika proteiner konformationer eller oligomeric stater. Vi beskriver märkning tillvägagångssätt och metoder för att kvantitativt analysera bindande.
Abstract
Fluorescerande proteiner och färgämnen är viktiga verktyg för studier av protein handel, lokalisering och funktion i celler. Medan fluorescerande proteiner såsom grön fluorescens protein (GFP) har i stor utsträckning använts som fusion partner till proteiner för att spåra egenskaper hos ett protein av intresse 1, den senaste tidens utveckling med mindre taggar möjliggöra nya funktioner av proteiner som skall undersökas i celler som conformationaländring och protein-förening 2, 3. En liten tagg-systemet innebär en tetracysteine motiv (CCXXCC) genetiskt in i ett målprotein, som binder till biarsenical färgämnen, ReAsH (röd fluorescerande) och Flash (grönt fluorescerande), med hög specificitet även i levande celler 2. TC / biarsenical dye-systemet erbjuder mycket mindre steriska begränsningar till värden protein än fluorescerande proteiner som har möjliggjort flera nya metoder för att mäta conformationaländring och protein-protein interaktioner 4-7. Vi har nyligen utvecklat en ny tillämpning av TC-taggar som sensorer av oligomerisering i celler som uttrycker mutant huntingtin, som när den muterat aggregat i nervceller i Huntingtons sjukdom 7. Huntingtin var märkta med två fluorescerande färger, en ett fluorescerande proteinet för att spåra proteiner plats, och den andra en TC-tagg som bara binder biarsenical färgämnen i monomerer. Därför aktiverat förändringar i colocalization mellan protein och biarsenical färgämnet reaktivitet submikroskopiska oligomerer innehåll vara geografiskt kartläggas i celler. Här beskriver vi hur etiketten TC-taggade proteiner smält till ett fluorescerande protein (Cherry, GFP eller GFP) med Flash eller ReAsH i levande däggdjursceller och hur man kan kvantifiera de två färg fluorescens (Körsbär / Flash, GFP / Flash eller GFP / ReAsH kombinationer).
Protocol
Discussion
Den metod för att märka protein lokalisering med en fluorescerande protein och konformationsanalys fastigheter med en andra färg ger stor potential för kartläggning där olika konformationer av proteiner uppstår i celler och händelser som förändrar dynamiken av protein konformation. ReAsH / Flash användes först som ett i-cell sensor för proteinveckning av däggdjur cellulär retinoinsyra-bindande protein I 4. I detta exempel Flash bunden till en TC tagg konstruerad i cellulär retinoinsyra-bindand…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete har finansierats av bidrag till DMH och TDM (NHMRC projektbidrag). DMH är ett Grimwade Fellow, som finansieras av Miegunyah Trust.
Materials
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
|---|---|---|---|
| 8-well μ-slides | Ibidi | 80826 | We find these chamber slides to be particularly useful for culturing cells for imaging. |
| TC-FlAsH II In-cell Tetracysteine Tag Detection Kit *green fluorescence* *for live-cell imaging | Invitrogen | T34561 (FlAsH) or T34562 (ReAsH) | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution | Invitrogen | 14175-103 | |
| 2,3-Dimercapto-1-propanol | Sigma-Aldrich | D1129-5ML | |
| 1,2-Ethanedithiol | Sigma-Aldrich | 02390-25ML |
References
- Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Ann. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).
- Griffin, B. A., Adams, S. R., Tsien, R. Y. Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells. Science. 281, 269-2672 (1998).
- Uttamapinant, C. A fluorophore ligase for site-specific protein labeling inside living cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 10914-10919 (2010).
- Ignatova, Z., Gierasch, L. M. Monitoring protein stability and aggregation in vivo by real-time fluorescent labeling. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 523-528 (2004).
- Coleman, B. M. Conformational detection of prion protein with biarsenical labeling and FlAsH fluorescence. Biochem. Biophys. Res. Commun. 380, 564-568 (2009).
- Luedtke, N. W., Dexter, R. J., Fried, D. B., Schepartz, A. Surveying polypeptide and protein domain conformation and association with FlASH and ReAsH. Nat. Chem. Biol. 3, 779-784 (2007).
- Ramdzan, Y. M. Conformation sensors that distinguish monomeric proteins from oligomers in live cells. Chem. Biol. 17, 371-379 (2010).
- Abramoff, M. a. g. e. l. h. a. e. s., PJ, S. J. R. a. m. Image processing with ImageJ. Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).
- Hearps, A. The biarsenical dye Lumio exhibits a reduced ability to specifically detect tetracysteine-containing proteins within live cells. J. Fluor. 17, 593-597 (2007).
- Adams, S. R. New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: Synthesis and biological applications. J. Am. Chem. Soc. 124, 6063-6076 (2002).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat. Meth. 2, 905-909 (2005).
