Summary
描述的方法来衡量新生儿缺氧缺血的生化标志物。该方法利用高压液相色谱（HPLC）和气相色谱质谱（GC / MS）。
Abstract
新生儿缺氧缺血的特点是一个组织的血流灌注不足或全身的氧气缺乏。这种情况被认为是造成/加剧据可查的新生儿疾病包括神经受损 1-3 。三磷酸腺苷生产下降的发生是由于缺乏氧化磷酸化的。为了弥补这种能量被剥夺的状态，含有高能磷酸债券分子退化 2 。这导致腺苷水平的提高，这是随后降解为肌苷，次黄嘌呤，黄嘌呤，最后以尿酸。黄嘌呤氧化还原酶在这个降解过程中的最后两个步骤进行。这种酶黄嘌呤脱氢酶的形式存在，常氧条件下，但转换下再灌注缺氧情况下，4，5黄嘌呤氧化酶（ XO）。与黄嘌呤脱氢酶，XO笔记本电脑生成过氧化氢 作为一种嘌呤降解4，6的副产品。这与其他缺氧时产生的活性氧（ROS），结合过氧化氢 的氧化尿酸形成尿囊素和脂质膜反应生成丙二醛（MDA）7-9。大多数哺乳动物，人类豁免，具有酶的尿酸， 尿酸转换尿囊素。然而，在人类中，尿囊素只能形成尿酸ROS介导的氧化。正因为如此，尿囊素被认为是人体氧化应激的标记，但在哺乳动物尿酸 。
我们描述了采用高压液相色谱（HPLC）和气相色谱质谱（GCMS）的方法来衡量新生儿缺氧缺血的生化标志物，人体血液是大多数测试使用。 动物血也可以使用，同时也认识到尿酸生成尿囊素的潜力。嘌呤代谢物与缺氧早在1963年和次黄嘌呤，黄嘌呤的可靠性，并为新生儿缺氧的生化指标的尿酸是由10-13几个调查验证。用于嘌呤类化合物的定量的高效液相色谱法快速，可靠，重现性好。 GC / MS方法用于量化尿囊素，一个相对较新的标志物的氧化应激，适应格鲁伯 等 7 。这种方法避免了一定的文物和需要的样品量低。描述其他地方所采用的方法合成MMDA 14，15。改编自Paroni 等的GC / MS MDA基于量化。 Cighetti 等 16，17。黄嘌呤氧化酶活性测定高效液相色谱法，通过量化蝶呤转换isoxanthopterin 18 。这种方法被证明是足够的敏感和重复性。
Protocol
1。样品的采集与加工
- 收集血液样本，在6毫升K3E EDTA K3管放在冰上。
- 收集2分钟内，离心机的样品在4 ° C时为10分钟的1500克。
- 上清（浆）转移到1.5ml离心管。
- 在4 ° C离心30分钟在18000克。
- 去除上清分装和嘌呤（200μL），尿囊素（50μL），MDA（100μL），和XO（120μl）分析他们转移到不同的离心管。要小心，不要污染与红血细胞的样品。您可能需要调整血浆MDA，XO，并根据血浆可用总量的嘌呤卷。
2。准备内部标准，2 - 氨基嘌呤（2 - AP），嘌呤和XO分析
- 称0.01351克2 - AP的，将它添加到过的水与盐酸2-5滴酸化8毫升。如果不溶于2 - AP，您需要添加更多的酸。调整最终体积至10ml。
- 使用紫外可见分光光度计，以确定你的股票2 - AP解决方案的真实浓度。 （315的λmax，ε4000）。
- 一旦股票的浓度2 - AP的解决方案是确定的，计算含有1 × 10 -7摩尔2 - AP内部嘌呤测量标准和1 × 10 -8 MOL 2 - AP内部的XO测量标准所需的卷。
- 分装成不同的离心管的计算量，并在SpeedVac蒸发至干。
公式1： 
公式（2）： 
3。高效液相色谱法测量嘌呤
- 传输血浆（200μL）一个单片机YM - 10离心式过滤装置和离心机在4 ° C时为1.5小时的14000克。
- 取出滤液转移到微量离心管中，含有1 × 10 -7摩尔2 - AP 。请务必记录滤液体积的离心管中，含有2 - AP。涡10-20秒的样品。
- 用HPLC分析的样本。三50μL注射用于每个样品。样品注入到一个Supelcosil LC - 18 - S，15厘米× 4.6毫米，5μm色谱柱配备一个Supelguard LC - 18 - S列后卫。应使用表1中所描述梯度条件获得足够的峰的分离度：一个水溶剂，溶剂B甲醇，溶剂的C - 50MM酸铵缓冲液，pH值5.5。
| 时间 | 流量（毫升/分钟） | ％A | ％B级 | ％C | |
| 1 | 1.00 | 0.0 | 0.0 | 100.0 | |
| 2 | 16.00 | 1.00 | 0.0 | 0.0 | 100.0 |
| 3 | 17.00 | 1.00 | 100.0 | 0.0 | 0.0 |
| 4 | 22.00 | 1.00 | 100.0 | 0.0 | 0.0 |
| 5 | 27.00 | 1.00 | 0.0 | 100.0 | 0.0 |
| 6 | 32.00 | 1.00 | 0.0 | 100.0 | 0.0 |
| 7 | 33.00 | 1.00 | 100.0 | 0.0 | 0.0 |
| 8 | 38.00 | 1.00 | 100.0 | 0.0 | 0.0 |
| 9 | 39.00 | 1.00 | 0.0 | 0.0 | 100.0 |
| 10 | 45.00 | 1.00 | 0.0 | 0.0 | 100.0 |
为嘌呤类化合物的高效液相色谱法测量见表1。溶剂的变化。
- 确定样品中的嘌呤浓度。次黄嘌呤，黄嘌呤，尿酸量化取得的保留和表2，确定2 - AP的峰面积的波长峰面积。面积比，次黄嘌呤，黄嘌呤和尿酸确定2 - AP和转换比率，使用标准曲线μmolar浓度。
| 保留时间* | 观察λ 最大 * | 报道λ 最大 19 | 报道ε 最大 19 | |
| 尿酸酸 | 〜3.5敏 | 288 | 283 [2] | 11500 [2] |
| 次黄嘌呤 | 〜7.0敏 | 248 | 248 [1] | 10800 [1] |
| 黄嘌呤 | 〜9.5分钟 | 267 | 267 [2] | 10200 [2] |
| 2 -氨基嘌呤 | 〜12.5分钟 | 305 | 314 [2] | 4000 [2] |
表2典型的保留时间和λ最大嘌呤和内部标准。 *对高效液相色谱法测定使用的为1ml/min的流速等度50MM酸铵缓冲液（pH值5.5）。 pH值是在[]。
- 分析所有样本一式三份，但只包括以供日后分析值的变异系数小于10％。
4。尿囊素的GC / MS测定
- 添加50μL10μMDL -尿囊素- 5 - 13℃; 1 - 15 N（内部标准）50μL血浆预留尿囊素检测过程中样品的采集和处理。
- 加入100μL乙腈这种等离子体的解决方案。
- 旋涡混合10-20秒，然后离心10分钟在4 ° C的20,000克。
- 取出上清液，放置在一个小瓶的GC / MS和干下N 2。
- 干燥后，加入50μL衍生剂N -叔丁基二甲基- N - methyltrifluoroacetamide（MTBSTFA）吡啶（1:1体积/体积），第小瓶，并培育他们在50 ° 2小时彗星衍生产量坚持量化为398.0和400.0米/ Z峰;尿囊素和DL -尿囊素- 5 - 13 C 1 - 15 N，分别为20。
- 分析样品，安捷伦6890N气相色谱和质谱5973配备了自动采样器。执行化合物的分离在Agilent 122 - 5532G的毛细管柱（25.7米长度，0.25毫米内部直径）。使用氦气作为载气，在流速为1.5毫升/分钟。注入分割模式（分流比20:1，分流29.4毫升/分，总流量33.8毫升/分）的衍生产品（1μL）。初始柱温设置为100 ° C和保持在该温度下2分钟，然后增加至180 ° C时，税率为10 ° C /分钟。保持温度为4分钟，再增加至260 ° C率在20 ° C /分钟。保持这个温度，直到运行结束。每个样品后，2注射正己烷清洗之列。
- 量化尿囊素使用DL -尿囊素- 5 - 13 C选择离子监测模式，同时监测了398.0米/ Z离子的尿囊素和400.0 m / z为离子; 1 - 15 N.尿囊素/（重尿囊素）的离子丰度比转换尿囊素微摩尔浓度，用事先准备好的标准曲线。
- 所有样品进行了分析，一式三份，但低于10％的变异系数的值只有在进一步分析使用。
5。 MDA的分析准备的内部标准，甲基丙二醛（MMDA），
- 在100毫升的圆底烧瓶中，加入523μl3 ethoxymethacrolein1477μl7M氢氧化钠。添加一个stirbar。
- 烧瓶置于水浴中，在45℃，搅拌，直到反应已经完成。这应该需要大约140分钟。在10分钟的间隔中删除的液体中加入10μl等份定期监测反应的进展。稀释收集每个样本由10 5 50 mM磷酸钾缓冲液（pH值7），测量的UV - Vis吸收的因素。一旦达到大约0.658的反应完全在275nm的吸光度。随着反应的进行，该解决方案将变成黄色，然后橙色。
- 允许的反应进度为一个额外的15分钟。
- 圆底烧瓶中加入蒸馏水去离子水5毫升和解决方案转移至分液漏斗。使用3毫升的水，洗成漏斗的烧瓶中的内容。添加额外的水2毫升漏斗。
- 用5毫升的二氯甲烷提取解决方案的3倍。每次提取后丢弃的有机层。
- 第三提取后，水层转移到圆底烧瓶中，并rotovap干燥。
- 悬浮在3毫升乙醇和产品转移到一个预先称重的15毫升锥形管。额外2毫升乙醇冲洗烧瓶中，并添加冲洗锥形管。
- 加入5ml苯和孵化管在温水中，直到产品溶解，然后立即置于冰上10分钟管。离心5分钟，15000克，去除上清。
- 加5ml乙醇和5毫升异丙醚的降雨雪itant。溶解的沉淀孵化管，并定期在温水中轻轻倾斜管。一旦被溶解析出，放置在冰管10分钟。执行此用乙醇和异丙醇醚重结晶2次以上。有些产品可能会形成不溶性的白色块。
- 最后再结晶步骤后删除尽可能多的可能和干燥造成的产品在Speedvac上清。权衡与合成产品的锥形管。
- 加5ml水，管，涡街，并过滤掉任何剩余的固体。
- 使用紫外可见分光光度计，以确定最终MMDA的浓度。 MMDA在50毫米磷酸钾缓冲液（pH值7）的λmax为274 nm的消光系数为29900 M -1厘米-1 14。
6。 MDA的气相色谱/质谱测量
- 准备0.5MM二丁基羟基甲苯（BTH）在乙醇溶液中加入0.11克BTH9毫升乙醇和调整最终体积至10ml。然后执行通过这种浓缩液990μl乙醇的加入中加入10μl稀释。
- 准备在一个黑暗的离心管中加入苯肼4.92μl水995μl的50MM苯肼的解决方案。涡的解决方案。
- 添加5μL10μMMMDA100μL血浆MDA的检测过程中样品的采集和处理拨出。
- 然后添加加入10μl0.5MM BTH此外200μL1M柠檬酸钠在 pH 4 MMDA /等离子混合物pH值是正确的样品衍生的关键。 较高或较低的pH值将导致歪斜MDA水平。
- 加入蒸馏水去离子水到终体积为480μl稀释的最终混合物。
- 加入20μL50MM苯肼，封盖的小瓶和解决方案，在25 ° C孵育30分钟轨道摇床的Derivatize解决方案。
- 添加正己烷，1分钟，10分钟3000转离心旋涡1毫升。
- 有机层转移到小瓶的GC / MS和集中由N 2流的解决方案，以100μL。
- 使用自动采样器上的GC / MS分析的样品。执行复合分离在Agilent 122 - 5532G毛细管柱（25.7米长，内部直径0.25毫米）。使用氦气作为载气，在0.6-0.8毫升/分钟的流速。注入分割模式（分流比20:1，分流23.0毫升/分，总流量27.1毫升/分）的衍生产品（2μL）。设置初始柱温为110 ° C和在该温度下保持1分钟前提高到250 ° C率在40 ° C /分钟。保持这个温度，直到运行结束。每个样品后，2注射正己烷清洗之列。
- 量化MDA的使用选择离子监测模式使用的144.00米/ MDA的Z和158.00米/ MMDA ž。转换的MDA / MMDA离子丰度比使用微摩尔浓度的标准曲线。
- 分析样品一式三份，并只使用值的变异系数小于10％。
7。高效液相色谱法测定黄嘌呤氧化酶
- 检测黄嘌呤氧化酶的功能是依赖于能够灵敏地测量一个合适的基板（蝶呤），以及其产品（isoxanthopterin）的水平。培养底物为4小时0分（对照组）或血浆，并确定向产品转化的孵化依赖基板。
- 加入240μl0.2 M Tris - HCl缓冲液（pH 9.0）和4.63μl7.083x10 -3 M蝶呤，以每管（0和4h）和preincubate在37℃下5分钟。
- 启动每管加入60μl血浆酶反应。
- 立即加入300μLHCLO 4 4％的控制管（0分），但允许其他混合物孵育淬火前4小时反应300μL4％HCLO 4 。
- 此外HCLO 4后，大力摇晃管，然后在4 ° C时，15000克离心15分钟。
- 取出上清液500μL和消除5M K 2 CO 3加入20μL。大力摇晃管，然后在4 ° C时，15000克离心15分钟。
- 加入350μl的瓦解解决微量离心管中，含有1 × 10 -8 MOL 2 - AP 。
- 配备扫描荧光检测样品的HPLC分析。三50μL注射用于每个样品。样品将被注入到一个Wacosil 5C - 18 - 200 250毫米× 6.0毫米，5微米配备一个Supelguard LC - 18 - S列后卫列。应采用以下的等度条件下获得足够的峰的分离和鉴定：95％20MM KPO 4缓冲液（pH值2.2）和5％的甲醇在流速1ml/min。设置在345 nm处的荧光检测的激发波长和发射波长长度为410 nm。
- 确定的pterine和isoxanthopterine 2 - AP获得荧光检测光谱峰面积的比率。频谱中的第一个高峰，〜5分钟，相当于2 - AP。第二和最大峰值将pterine。 Isoxanthopterine高峰洗脱去年。
- 获取的isoxanthopterine/2-AP峰面积比0和孵育4 h时间点之间的差异。使用此值来计算从标准曲线的XO活动。
- 分析样本一式三份，但使用唯一值的变异系数小于10％。
8。代表性的成果：
嘌呤类化合物的高效液相色谱定量的一个例子如图 1a所示。具体的保留时间和发射波长的次黄嘌呤，黄嘌呤，尿酸许可证的嘌呤类化合物的同时的定量（见表2）。检测是正常运行时，该化合物将有足够的分离和峰形尖锐和单峰。这些峰值，然后将其转换成浓度范围如表3所示，通过使用标准曲线。因为这个实验中的样品处理是最小的，只有基于样本可能出现的问题将红细胞裂解。如果红血细胞裂解样品离心前，等离子将采取橙色/红色，不能用于评估缺氧缺血。在测量嘌呤时可能出现的的其他问题涉及的高效液相色谱系统和列（ 图 1B ）。如果有气泡在高效液相色谱系统的保留时间将转向和高效液相色谱法的压力将大幅波动。如果后卫墨盒需要改变，压力将会增加，峰将扩大，并成为双向或三模态。
| 次黄嘌呤（微米） | 黄嘌呤（微米） | 尿酸（微米） | 黄嘌呤氧化酶（（nmol产品）/分钟） | 丙二醛（微米） | 尿囊素（微米） | |
| 长期常氧 | 1.13-19.3（64） | 0.02-3.69（61） | 107.20-726.12（63） | 2.47x10 -6 - 3.92x10 -3（20） | 0.44-3.76（53） | 不适用 |
| 期呼吸窘迫 | 1.78-12.59（27） | 0.07-11.8（24） | 225.40-653.32（27） | 0 - 1.03x10 -5（8） | 0.82-2.73（24） | 不适用 |
| 长期缺氧 | 0.38-31.80（13） | 0.11-2.88（13） | 235.65-1348.13（13） | 1.20x10 -5 -236.44（9） | 0.95-2.15（7） | 不适用 |
| 早产儿常氧 | 1.54-4.39（9） | 0.03-1.77（9） | 178.92-593.49（9） | 2.46x10 -5 - 5.44x10 -4（2） | 0.95-2.74（8） | 2.30-5.26（67） |
| 早产儿呼吸困境 | 3.04-8.04（2） | 不适用 | 327.56-365.11（2） | 不适用 | 2.40-3.46（3） | 不适用 |
最小 - 最大（N）
表3。嘌呤，黄嘌呤氧化酶，丙二醛和尿囊素的代表范围。
尿囊素的GC / MS定量的一个例子是如图 2所示。由于derivitized尿囊素和derivitized重尿囊素的质量是已知的，选择离子模式可以被用来确定这些化合物的质谱。如果检测是正确的，两峰将在相同保留时间的观察。一个相应的尿囊素（398.00 M / Z）和其他重尿囊素（400.00 M / Z）。这些峰值，然后将其转换成浓度范围如表3所示，通过使用标准曲线。如果实验运行不正确，样本不正确derivitized，峰值可能不存在或可能不定量的代表性。再次，如果红细胞裂解等离子不能被用来评价新生儿缺氧缺血氧化应激。
MDA的量化结果尿囊素那些与观察到的异常是在不同的保留时间，两峰的相似。应〜3.5分钟的保留时间，144.00 m / z为MDA和高峰〜4分钟的保留时间，一个158.00米/ Z峰值为MMDA观察（ 图3）。这些峰值，然后将其转换成浓度范围如表3所示，通过使用标准曲线。如果实验运行不正确，或样本是不derivitized正确，无峰144.00米/ z和158.00米/ Z选择时，可观察应该指出，如果有超过丸口服喂食或静脉注射脂质管理的血浆脂质，血浆将采取一种乳白色的外观，并不能用来评估新生儿缺氧缺血氧化应激。
高效液相色谱法为基础的定量黄嘌呤氧化酶的功能的一个例子是如图4所示。如果检测是正常运行，三个峰，应观察与荧光检测器，一个为蝶呤isoxanthopterin之一，2 - AP之一。这些峰值，然后将其转换成浓度范围如表3所示，通过使用标准曲线。还应该有一个峰值对应isoxanthopterin和2 - AP从PDA检测器所产生的频谱。如果缺少酶的活性，对应isoxanthopterin高峰将不可见。由于这种检测措施酶的功能，反复冻融和样品解冻，可能会改变这一点。
图1。高效液相色谱法谱嘌呤类化合物的鉴定。 A）。代表性的结果，如果检测正常运行。 B）。代表性的结果，如果有一个问题，用高效液相色谱仪，列，或保护盒。
图2。 GC / MS谱尿囊素的量化 。离子398.00峰的m / z对应尿囊素。离子400.00米/ Z的峰值对应于沉重尿囊素。
图3。 GC / MS的量化MDA的频谱。离子144.00米/ Z峰值对应到MDA。离子158.00米/ Z峰值对应MMDA。
图4。高效液相色谱法光谱测量的XO活动。）代表0分钟的孵育时间和孵化时间为4小时b）代表结果结果。请注意，较高的孵化时间为4小时isoxanthopterine高峰（〜17分钟）。在荧光光谱中，2 - AP流出第一〜5min和pterine流出〜10分钟的未来。
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Discussion
这里所描述的方法，允许新生儿缺氧缺血的评价。该协议结合的能量（ATP）剥夺，氧化应激，氧化损伤，酶的活性标志物的测量，以获得一个整体的存在生化图片甚至缺氧缺血程度。尽管这种方法的有效性，也有潜在的局限性。首先，它需要大约1-2毫升血液收集到足够的血浆运行的所有实验。这会不会是成人或儿童的问题，但新生儿，特别是那些过早时，它成为一个关注。优先检测和稀释的一些样品如果有必要，我们要解决这个问题，其次，它可以是很难合成MMDA的;然而，氘MDA可以用来作为替代MMDA作为内部标准。
尽管有这些限制，描述的方法提供了一个有用的工具，在评估新生儿缺氧缺血以及其他疾病相关的氧化还原稳态不平衡。此外，所有这些标记的XO异常，可在尿液中测量，监测新生儿提供一种非侵入性手段。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是由美国国立健康R01 NR011209 - 03研究院
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6ml K3E EDTA K3 tube | Fisher Scientific | 2204061 | |
| 5702R centrifuge | Fisher Scientific | 05413319 | With 13&16MM adaptor |
| 1.5ml microcentrifuge tube | USA Scientific, Inc. | 1615-5599 | |
| 2-Aminopurine | Sigma-Aldrich | A3509 | |
| Varian Cary 100 spectrophotometer | Agilent Technologies | 0010071500 | |
| Savant SpeedVac | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SC210A-115 | |
| Micron centrifugal filter device | Fisher Scientific | UFC501596 | |
| Supelcosil LC-18-S Column | Sigma-Aldrich | 58931 | |
| Supelcosil LC-18-S Supelguard cartridge and holder | Sigma-Aldrich | 59629 | |
| HPLC | Waters | ||
| GCMS Vial | Fisher Scientific | 03376607 | |
| DL-Allantoin-5-13C;1-15N | CDN Isotopes | M-2307 | Lot #L340P9 |
| MTBSTFA | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 48920 | |
| Pyridine | Sigma-Aldrich | 270970 | |
| 5973E GC/MSD | Agilent Technologies | G7021A | Part # for 5975E GC/MS |
| 3-Ethoxymethacrolein | Sigma-Aldrich | 232548 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 270997 | |
| Benzene | Sigma-Aldrich | 401765 | |
| Diisopropyl ether | Sigma-Aldrich | 38270 | |
| BHT | Sigma-Aldrich | B1378 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 459844 | |
| Phenylhydrazine | Sigma-Aldrich | P26252 |
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