Mesure biochimique de l'hypoxie néonatale
Summary
Une méthode est décrite pour mesurer les marqueurs biochimiques du hypoxie-ischémie néonatale. L'approche utilise la chromatographie liquide à haute pression (HPLC) et chromatographie en phase gazeuse spectrométrie de masse (GC / MS).
Abstract
L'ischémie néonatale hypoxie est caractérisée par une perfusion sanguine insuffisante d'un tissu ou un manque d'oxygène systémique. Cette condition est pensé pour causer / exacerbent bien documenté troubles néonatals, y compris des troubles neurologiques 1-3. Baisse de la production d'adénosine triphosphate est due à un manque de phosphorylation oxydative. Pour compenser cet état molécules énergétiques privés contenant de fortes liaisons phosphate de l'énergie sont deux dégradées. Cela conduit à des niveaux accrus de l'adénosine qui est ensuite dégradé en inosine, hypoxanthine, la xanthine, et enfin de l'acide urique. Les deux dernières étapes dans ce processus de dégradation sont effectuées par la xanthine oxydoréductase. Cette enzyme existe sous la forme de la xanthine déshydrogénase dans des conditions normoxique mais il est converti en xanthine oxydase (XO) sous hypoxie-reperfusion circonstances 4, 5. Contrairement déshydrogénase xanthine, XO génère du peroxyde d'hydrogène comme sous-produit de dégradation de la purine 4, 6. Ce peroxyde d'hydrogène en combinaison avec d'autres espèces d'oxygène réactif (ROS) produites pendant l'hypoxie, l'acide urique s'oxyde pour former de l'allantoïne et réagit avec des membranes lipidiques pour générer malondialdéhyde (MDA) 7-9. La plupart des mammifères, les humains exemptés, possèdent les uricase, qui convertit l'acide urique en allantoïne. Chez l'homme, cependant, l'allantoïne ne peut être formé par les ROS-oxydation médiée de l'acide urique. Pour cette raison, l'allantoïne est considéré comme un marqueur du stress oxydatif chez les humains, mais pas chez les mammifères qui ont uricase.
Nous décrivons des méthodes employant la chromatographie liquide à haute pression (HPLC) et chromatographie en phase gazeuse spectrométrie de masse (GCMS) pour mesurer les marqueurs biochimiques d'ischémie hypoxie néonatale. Le sang humain est utilisé pour la plupart des tests. Le sang des animaux peuvent également être utilisés, tout en reconnaissant le potentiel d'uricase généré allantoïne. Métabolites de purine ont été liés à l'hypoxie dès 1963 et la fiabilité de hypoxanthine, la xanthine, et l'acide urique comme des indicateurs biochimiques de l'hypoxie néonatale a été validé par plusieurs enquêteurs 10-13. La méthode HPLC utilisée pour la quantification de composés purine est rapide, fiable et reproductible. La méthode GC / MS utilisé pour la quantification de l'allantoïne, un marqueur relativement nouveau du stress oxydatif, a été adapté de Gruber et al 7. Cette méthode évite certains artefacts et nécessite de faibles volumes d'échantillon. Les méthodes utilisées pour la synthèse de MMDA ont été décrits par ailleurs 14, 15. GC / MS quantification basée sur MDA a été adapté à partir Paroni et al. et Cighetti et al. 16, 17. Xanthine oxydase a été mesurée par HPLC en quantifiant la conversion de ptérine d'isoxanthopterin 18. Cette approche s'est avérée être suffisamment sensible et reproductible.
Protocol
Discussion
Les méthodes décrites ici permettent l'évaluation de l'ischémie hypoxie néonatale. Ce protocole combine les mesures de marqueurs de l'énergie (ATP) la privation, le stress oxydatif, dommage oxydatif, et l'activité enzymatique de gagner une image globale biochimique de la présence ou même le degré d'ischémie hypoxique. Malgré l'utilité de cette méthode, il ya des limites potentielles. Premièrement, il faut environ 1-2 ml de sang pour recueillir suffisamment de plasma pour exécuter …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail est financé par les Instituts nationaux de la santé R01-03 NR011209
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| 6ml K3E EDTA K3 tube | Fisher Scientific | 2204061 | |
| 5702R centrifuge | Fisher Scientific | 05413319 | With 13&16MM adaptor |
| 1.5ml microcentrifuge tube | USA Scientific | 1615-5599 | |
| 2-Aminopurine | Sigma-Aldrich | A3509 | |
| Varian Cary 100 spectrophotometer | Agilant Technologies | 0010071500 | |
| Savant SpeedVac | Thermo Scientific | SC210A-115 | |
| Micron centrifugal filter device | Fisher Scientific | UFC501596 | |
| Supelcosil LC-18-S Column | Sigma-Aldrich | 58931 | |
| Supelcosil LC-18-S Supelguard cartridge and holder | Sigma-Aldrich | 59629 | |
| HPLC | Waters | ||
| GCMS Vial | Fisher Scientific | 03376607 | |
| DL-Allantoin-5-13C;1-15N | CDN Isotopes | M-2307 | Lot #L340P9 |
| MTBSTFA | Thermo Scientific | 48920 | |
| Pyridine | Sigma-Aldrich | 270970 | |
| 5973E GC/MSD | Agilent Technologies | G7021A | Part # for 5975E GC/MS |
| 3-Ethoxymethacrolein | Sigma-Aldrich | 232548 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 270997 | |
| Benzene | Sigma-Aldrich | 401765 | |
| Diisopropyl ether | Sigma-Aldrich | 38270 | |
| BHT | Sigma-Aldrich | B1378 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 459844 | |
| Phenylhydrazine | Sigma-Aldrich | P26252 |
References
- Harkness, R. A., Whitelaw, A. G., Simmonds, R. J. Intrapartum hypoxia: the association between neurological assessment of damage and abnormal excretion of ATP metabolites. J Clin Pathol. 35, 999-1007 (1982).
- Shalak, L., Perlman, J. M. Hypoxic-ischemic brain injury in the term infant-current concepts. Early Hum Dev. 80, 125-141 (2004).
- Webster, W. S., Abela, D. The effect of hypoxia in development. Birth Defects Res C Embryo Today. 81, 215-228 (2007).
- Engerson, T. D., McKelvey, T. G., Rhyne, D. B., Boggio, E. B., Snyder, S. J., Jones, H. P. Conversion of xanthine dehydrogenase to oxidase in ischemic rat tissues. J Clin Invest. 79, 1564-1570 (1987).
- Choi, E. Y., Stockert, A. L., Leimkuhler, S., Hille, R. Studies on the mechanism of action of xanthine oxidase. J Inorg Biochem. 98, 841-848 (2004).
- Godber, B. L., Schwarz, G., Mendel, R. R., Lowe, D. J., Bray, R. C., Eisenthal, R. Molecular characterization of human xanthine oxidoreductase: the enzyme is grossly deficient in molybdenum and substantially deficient in iron-sulphur centres. Biochem J. 388, 501-508 (2005).
- Gruber, J., Tang, S. Y., Jenner, A. M., Mudway, I., Blomberg, A., Behndig, A. Allantoin in human plasma, serum, and nasal-lining fluids as a biomarker of oxidative stress: avoiding artifacts and establishing real in vivo concentrations. Antioxid Redox Signal. 11, 1767-1776 (2009).
- Zitnanova, I., Korytar, P., Aruoma, O. I., Sustrova, M., Garaiova, I., Muchova, J. Uric acid and allantoin levels in Down syndrome: antioxidant and oxidative stress mechanisms?. Clin Chim Acta. 341, 139-146 (2004).
- Siciarz, A., Weinberger, B., Witz, G., Hiatt, M., Hegyi, T. Urinary thiobarbituric acid-reacting substances as potential biomarkers of intrauterine hypoxia. Arch Pediatr Adolesc Med. 155, 718-722 (2001).
- Buonocore, G., Perrone, S., Longini, M., Terzuoli, L., Bracci, R. Total hydroperoxide and advanced oxidation protein products in preterm hypoxic babies. Pediatr Res. 47, 221-224 (2000).
- Berne, R. M. Cardiac nucleotides in hypoxia: possible role in regulation of coronary blood flow. Am J Physiol. 204, 317-322 (1963).
- Harkness, R. A., Lund, R. J. Cerebrospinal fluid concentrations of hypoxanthine, xanthine, uridine and inosine: high concentrations of the ATP metabolite, hypoxanthine, after hypoxia. J Clin Pathol. 36, 1-8 (1983).
- Plank, M. S., Boskovic, D. S., Sowers, L. C., Angeles, D. M. Biochemical markers of neonatal hypoxia. Pediatric Health. 2, 485-501 (2008).
- Cighetti, G., Allevi, P., Anastasia, L., Bortone, L., Paroni, R. Use of methyl malondialdehyde as an internal standard for malondialdehyde detection: validation by isotope-dilution gas chromatography-mass spectrometry. Clin Chem. 48, 2266-2269 (2002).
- Paroni, R., Fermo, I., Cighetti, G. Validation of methyl malondialdehyde as internal standard for malondialdehyde detection by capillary electrophoresis. Anal Biochem. 307, 92-98 (2002).
- Cighetti, G., Debiasi, S., Ciuffreda, P., Allevi, P. Beta-ethoxyacrolein contamination increases malondialdehyde inhibition of milk xanthine oxidase activity. Free Radic Biol Med. 25, 818-825 (1998).
- Cighetti, G., Debiasi, S., Paroni, R., Allevi, P. Free and total malondialdehyde assessment in biological matrices by gas chromatography-mass spectrometry: what is needed for an accurate detection. Anal Biochem. 266, 222-229 (1999).
- Yamamoto, T., Moriwaki, Y., Takahashi, S., Tsutsumi, Z., Yamakita, J., Nasako, Y. Determination of human plasma xanthine oxidase activity by high-performance liquid chromatography. J Chromatogr B Biomed Appl. 681, 395-400 (1996).
- Fasman, G. . Handbook of Biochemistry and Molecular Biology. , (1988).
- Chen, X. B., Calder, A. G., Prasitkusol, P., Kyle, D. J., Jayasuriya, M. C. Determination of 15N isotopic enrichment and concentrations of allantoin and uric acid in urine by gas chromatography/mass spectrometry. J Mass Spectrom. 33, 130-137 (1998).
