Biochemische Meting van Neonatale Hypoxie
Summary
Een methode wordt beschreven om biochemische markers van neonatale hypoxie-ischemie te meten. De aanpak maakt gebruik van hoge druk vloeistofchromatografie (HPLC) en gaschromatografie-massaspectrometrie (GC / MS).
Abstract
Neonatale hypoxie ischemie wordt gekenmerkt door onvoldoende bloeddoorstroming van een weefsel of een systemische gebrek aan zuurstof. Deze voorwaarde wordt gedacht dat oorzaak / goed gedocumenteerd neonatale neurologische aandoeningen, waaronder bijzondere waardeverminderingen 1-3 verergeren. Verminderde productie van adenosine trifosfaat optreedt als gevolg van een gebrek aan oxidatieve fosforylering. Ter compensatie van deze energie verstoken status moleculen die bestaan uit hoge energie-fosfaat obligaties zijn afgebroken 2. Dit leidt tot verhoogde niveaus van adenosine, die wordt vervolgens afgebroken tot inosine, hypoxanthine, xanthine, en uiteindelijk naar urinezuur. De laatste twee stappen in dit proces degradatie worden uitgevoerd door xanthine oxidoreductase. Dit enzym bestaat in de vorm van xanthine dehydrogenase onder normoxische omstandigheden, maar wordt omgezet in xanthine-oxidase (XO) onder hypoxie-reperfusie omstandigheden 4, 5. In tegenstelling tot xanthine dehydrogenase, XO genereert waterstofperoxide als een bijproduct van purine degradatie 4, 6. Deze waterstof-peroxide in combinatie met andere reactive oxygen species (ROS) geproduceerd tijdens hypoxie, oxideert urinezuur te vormen allantoïne en reageert met lipide membranen te genereren malondialdehyde (MDA) 7-9. De meeste zoogdieren, de mens uitgezonderd, bezitten het enzym uricase, die zet urinezuur naar allantoïne. Bij de mens kan echter allantoïne alleen worden gevormd door ROS-gemedieerde oxidatie van urinezuur. Vanwege dit, is allantoïne beschouwd als een marker van oxidatieve stress bij mensen te zijn, maar niet in de zoogdieren die uricase hebben.
We beschrijven methoden gebruik hoge druk vloeistofchromatografie (HPLC) en gaschromatografie massaspectrometrie (GCMS) om biochemische markers van neonatale hypoxie ischemie te meten. Menselijk bloed wordt gebruikt voor de meeste tests. Dierlijk bloed kan ook worden gebruikt met erkenning van het potentieel voor uricase gegenereerde allantoïne. Purine metabolieten waren gekoppeld aan hypoxie al in 1963 en de betrouwbaarheid van hypoxanthine, xanthine, en urinezuur als biochemische indicatoren van de neonatale hypoxie werd gevalideerd door verschillende onderzoekers 10-13. De HPLC-methode wordt gebruikt voor de kwantificering van purine verbindingen is snel, betrouwbaar en reproduceerbaar zijn. De GC / MS methode die wordt gebruikt voor de kwantificering van allantoïne, een relatief nieuwe marker van oxidatieve stress, werd aangepast van Gruber et al. 7. Deze methode vermijdt bepaalde artefacten en vereist lage volumes van het monster. Methoden die worden gebruikt voor de synthese van MMDA werden elders 14 beschreven, 15. GC / MS kwantificering van de MDA was aangepast van Paroni et al.. en Cighetti et al.. 16, 17. Xanthine oxidase activiteit werd gemeten door middel van HPLC door het kwantificeren van de omzetting van pterine aan isoxanthopterin 18. Deze aanpak bleek voldoende gevoelig en reproduceerbaar.
Protocol
Discussion
De methoden die hier beschreven staat de evaluatie van de neonatale hypoxie ischemie. Dit protocol combineert de metingen van markers van energie (ATP) deprivatie, oxidatieve stress, oxidatieve schade, en de enzymactiviteit te verkrijgen een algemene biochemische beeld van de aanwezigheid of zelfs de mate van hypoxische ischemie. Ondanks het nut van deze methode, zijn er mogelijke beperkingen. Ten eerste duurt het ongeveer 1-2 ml bloed om genoeg plasma te verzamelen om alle testen uit te voeren. Dit zal geen probleem zi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk wordt gefinancierd door National Institutes of Health R01 NR011209-03
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| 6ml K3E EDTA K3 tube | Fisher Scientific | 2204061 | |
| 5702R centrifuge | Fisher Scientific | 05413319 | With 13&16MM adaptor |
| 1.5ml microcentrifuge tube | USA Scientific | 1615-5599 | |
| 2-Aminopurine | Sigma-Aldrich | A3509 | |
| Varian Cary 100 spectrophotometer | Agilant Technologies | 0010071500 | |
| Savant SpeedVac | Thermo Scientific | SC210A-115 | |
| Micron centrifugal filter device | Fisher Scientific | UFC501596 | |
| Supelcosil LC-18-S Column | Sigma-Aldrich | 58931 | |
| Supelcosil LC-18-S Supelguard cartridge and holder | Sigma-Aldrich | 59629 | |
| HPLC | Waters | ||
| GCMS Vial | Fisher Scientific | 03376607 | |
| DL-Allantoin-5-13C;1-15N | CDN Isotopes | M-2307 | Lot #L340P9 |
| MTBSTFA | Thermo Scientific | 48920 | |
| Pyridine | Sigma-Aldrich | 270970 | |
| 5973E GC/MSD | Agilent Technologies | G7021A | Part # for 5975E GC/MS |
| 3-Ethoxymethacrolein | Sigma-Aldrich | 232548 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 270997 | |
| Benzene | Sigma-Aldrich | 401765 | |
| Diisopropyl ether | Sigma-Aldrich | 38270 | |
| BHT | Sigma-Aldrich | B1378 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 459844 | |
| Phenylhydrazine | Sigma-Aldrich | P26252 |
References
- Harkness, R. A., Whitelaw, A. G., Simmonds, R. J. Intrapartum hypoxia: the association between neurological assessment of damage and abnormal excretion of ATP metabolites. J Clin Pathol. 35, 999-1007 (1982).
- Shalak, L., Perlman, J. M. Hypoxic-ischemic brain injury in the term infant-current concepts. Early Hum Dev. 80, 125-141 (2004).
- Webster, W. S., Abela, D. The effect of hypoxia in development. Birth Defects Res C Embryo Today. 81, 215-228 (2007).
- Engerson, T. D., McKelvey, T. G., Rhyne, D. B., Boggio, E. B., Snyder, S. J., Jones, H. P. Conversion of xanthine dehydrogenase to oxidase in ischemic rat tissues. J Clin Invest. 79, 1564-1570 (1987).
- Choi, E. Y., Stockert, A. L., Leimkuhler, S., Hille, R. Studies on the mechanism of action of xanthine oxidase. J Inorg Biochem. 98, 841-848 (2004).
- Godber, B. L., Schwarz, G., Mendel, R. R., Lowe, D. J., Bray, R. C., Eisenthal, R. Molecular characterization of human xanthine oxidoreductase: the enzyme is grossly deficient in molybdenum and substantially deficient in iron-sulphur centres. Biochem J. 388, 501-508 (2005).
- Gruber, J., Tang, S. Y., Jenner, A. M., Mudway, I., Blomberg, A., Behndig, A. Allantoin in human plasma, serum, and nasal-lining fluids as a biomarker of oxidative stress: avoiding artifacts and establishing real in vivo concentrations. Antioxid Redox Signal. 11, 1767-1776 (2009).
- Zitnanova, I., Korytar, P., Aruoma, O. I., Sustrova, M., Garaiova, I., Muchova, J. Uric acid and allantoin levels in Down syndrome: antioxidant and oxidative stress mechanisms?. Clin Chim Acta. 341, 139-146 (2004).
- Siciarz, A., Weinberger, B., Witz, G., Hiatt, M., Hegyi, T. Urinary thiobarbituric acid-reacting substances as potential biomarkers of intrauterine hypoxia. Arch Pediatr Adolesc Med. 155, 718-722 (2001).
- Buonocore, G., Perrone, S., Longini, M., Terzuoli, L., Bracci, R. Total hydroperoxide and advanced oxidation protein products in preterm hypoxic babies. Pediatr Res. 47, 221-224 (2000).
- Berne, R. M. Cardiac nucleotides in hypoxia: possible role in regulation of coronary blood flow. Am J Physiol. 204, 317-322 (1963).
- Harkness, R. A., Lund, R. J. Cerebrospinal fluid concentrations of hypoxanthine, xanthine, uridine and inosine: high concentrations of the ATP metabolite, hypoxanthine, after hypoxia. J Clin Pathol. 36, 1-8 (1983).
- Plank, M. S., Boskovic, D. S., Sowers, L. C., Angeles, D. M. Biochemical markers of neonatal hypoxia. Pediatric Health. 2, 485-501 (2008).
- Cighetti, G., Allevi, P., Anastasia, L., Bortone, L., Paroni, R. Use of methyl malondialdehyde as an internal standard for malondialdehyde detection: validation by isotope-dilution gas chromatography-mass spectrometry. Clin Chem. 48, 2266-2269 (2002).
- Paroni, R., Fermo, I., Cighetti, G. Validation of methyl malondialdehyde as internal standard for malondialdehyde detection by capillary electrophoresis. Anal Biochem. 307, 92-98 (2002).
- Cighetti, G., Debiasi, S., Ciuffreda, P., Allevi, P. Beta-ethoxyacrolein contamination increases malondialdehyde inhibition of milk xanthine oxidase activity. Free Radic Biol Med. 25, 818-825 (1998).
- Cighetti, G., Debiasi, S., Paroni, R., Allevi, P. Free and total malondialdehyde assessment in biological matrices by gas chromatography-mass spectrometry: what is needed for an accurate detection. Anal Biochem. 266, 222-229 (1999).
- Yamamoto, T., Moriwaki, Y., Takahashi, S., Tsutsumi, Z., Yamakita, J., Nasako, Y. Determination of human plasma xanthine oxidase activity by high-performance liquid chromatography. J Chromatogr B Biomed Appl. 681, 395-400 (1996).
- Fasman, G. . Handbook of Biochemistry and Molecular Biology. , (1988).
- Chen, X. B., Calder, A. G., Prasitkusol, P., Kyle, D. J., Jayasuriya, M. C. Determination of 15N isotopic enrichment and concentrations of allantoin and uric acid in urine by gas chromatography/mass spectrometry. J Mass Spectrom. 33, 130-137 (1998).
