Het testen van eiwit-eiwit interacties is onmisbaar voor dissectie van eiwitten functionaliteit. Hier introduceren we een<em> In vitro</em> Eiwit-eiwit binding assay aan een membraan-geïmmobiliseerde eiwit probe met een oplosbare proteïne. Deze test geeft een betrouwbare methode om de interactie tussen een onoplosbaar eiwit en een eiwit in oplossing te testen.
Valideren van interacties tussen verschillende eiwitten is van vitaal belang voor het onderzoek van hun biologische functies op het moleculaire niveau. Er zijn verschillende methoden, zowel in vitro als in vivo, de eiwitbinding te evalueren, en ten minste twee methoden die de tekortkomingen van elkaar aan te vullen moeten worden uitgevoerd om betrouwbare inzichten te verkrijgen.
Voor een in-vivo assay, de bimoleculaire fluorescentie invulling (BiFC) test de meest populaire en minst ingrijpende aanpak die in staat stelt om eiwit-eiwit interacties te detecteren binnen levende cellen vertegenwoordigt, evenals identificeren van de intracellulaire lokalisatie van de interagerende eiwitten 1,2. In deze test, niet-fluorescerende N-en C-terminale helften van GFP of zijn varianten gefuseerd met getest eiwitten, en wanneer de twee fusie-eiwitten bij elkaar worden gebracht als gevolg van de geteste eiwitten 'interacties, is het fluorescerende signaal gereconstitueerde 3-6 . Omdat het signaal is makkelijk te detecteren door epifluorescentie of confocale microscopie, heeft BiFC ontpopt als een krachtig instrument van keuze tussen celbiologen voor het bestuderen van over eiwit-eiwit interacties in levende cellen 3. Deze test kan echter soms leiden tot valse positieve resultaten. Bijvoorbeeld, kan het fluorescerende signaal worden opgelost door twee GFP fragmenten voor zover geregeld 7 nm van elkaar als gevolg van nauwe verpakken in een kleine subcellulaire compartiment, in plaats van dat als gevolg van specifieke interacties 7.
Als gevolg van deze beperkingen, moeten de resultaten van live-cell imaging-technologieën worden bevestigd door een onafhankelijke aanpak op basis van een ander principe voor het detecteren van eiwit interacties. Co-immunoprecipitatie (Co-IP) of glutathion transferase (GST) pull-down assays vertegenwoordigen dergelijke alternatieve methoden die vaak worden gebruikt om eiwit-eiwit interacties in vitro te analyseren. Echter IIn deze onderzoeken moet echter de geteste eiwitten worden gemakkelijk oplosbaar zijn in de buffer die supportsused voor de binding reactie. Daarom kan specifieke interacties met betrekking tot een onoplosbaar eiwit niet worden beoordeeld door deze technieken.
Hier, illustreren we het protocol voor het eiwit membraan overlay bindingstest, die dit probleem omzeilt. In deze techniek kan de interactie tussen oplosbare en onoplosbare eiwitten betrouwbaar getest worden omdat een van de eiwitten is geïmmobiliseerd op een membraan matrix. Deze methode, in combinatie met de in vivo experimenten, zoals BiFC, biedt een betrouwbare benadering te onderzoeken en trouw karakteriseren interacties tussen oplosbare en onoplosbare eiwitten. In dit artikel, binding tussen Tobacco mosaic virus (TMV) beweging eiwit (MP), die meerdere functies uitoefent bij virale cel-cel transport 8-14, en een recent geïdentificeerde plant cellulaire interactor, tabak ankyrin herhaal-bevattende proteïne (ANK ) 15, wordt aangetoond met behulp van deze techniek.
Deze aanpak is geschikt voor het testen van eiwit-eiwit interacties tussen combinaties van de eiwitten, wanneer ten minste een van de eiwitten is goed oplosbaar in de bindende buffer, en met succes werd toegepast op andere combinatie van eiwitten 17,18. De iInteractions tussen de eiwitten die zowel onoplosbare onder deze omstandigheden niet kunnen worden getest door dit protocol.
Ook succesvolle hervouwing van ProIM is van cruciaal belang voor de test. Het spoelen van de membraan …
The authors have nothing to disclose.
Het werk in ons laboratorium wordt ondersteund door subsidies van NIH, USDA Nationaal Instituut voor Voedsel-en Landbouworganisatie, NSF, BARD, DOE, en BSF naar VC
Name of the reagent | Company | Catalog number |
Protein assay kit | Bio-Rad | 500-0001 |
Proteinase inhibitor cocktail | SIGMA | S8820 |
Mini-PROTEAN system | Bio-RAD | 165-8000 |
Semi-dry western blotting SD electrotransfer system | Bio-RAD | 170-3940 |
Anti-rabbit IgG antibody conjugated with horse radish peroxidase | GenScript | A00098 |
Anti-GST rabbit polyclonal antibody | GenScript | A00097 |
Anti-strepII | GenScript | A00626 |
BioTrace, NT nitrocellulose transfer membrane | Pall Scientific | 27377-000 |
Immobilon western chemiluminescent HRP substrate | Millipore | WBKL S0 050 |