חלבון ממברנה Assay Overlay: פרוטוקול בדיקת אינטראקציה בין חלבונים מסיסים ובחלקם לא מסיסים במבחנה</em
Summary
חלבונים אינטראקציה בדיקה הכרחית לנתיחה של פונקציונליות חלבון. הנה, אנחנו מציגים<em> במבחנה</em> חלבונים assay מחייב בדיקה קרום משותקת חלבון עם חלבון מסיס. Assay זה מספק שיטה אמינה לבדיקת האינטראקציה בין חלבון מסיס לבין חלבון בתמיסה.
Abstract
אינטראקציות בין חלבונים שונים לאישור חיוני לחקירה של פונקציות הביולוגיים ברמה המולקולרית. ישנן מספר שיטות, הן במבחנה in vivo, כדי להעריך מחייב חלבון, לפחות שתי שיטות המשלימות את החסרונות של כל אחד אחר צריך להתנהל כדי להשיג תובנות אמין.
עבור assay ב vivo, השלמה הקרינה bimolecular (BiFC) assay מייצג את הגישה הפופולרית ביותר פולשנית לפחות המאפשרת לזהות חלבונים אינטראקציה בתוך תאים חיים, כמו גם לזהות את לוקליזציה תאיים של 1,2 החלבונים אינטראקציה. ב assay זה, אי – ניאון N-ו-C-מסוף חצאים של ה-GFP או גירסאותיה הם התמזגו חלבונים נבדק, וכאשר שני חלבונים היתוך הם הביאו יחד בשל אינטראקציות החלבונים "נבדק, האות ניאון הוא מחדש 3-6 . בגלל האות שלו ניתן לזהות בקלות על ידי מיקרוסקופיה epifluorescence או confocal, BiFC התפתחה ככלי רב עוצמה של בחירה בין ביולוגים התא ללימוד על חלבונים אינטראקציות בתאים חיים 3. Assay עם זאת, לפעמים יכול להניב תוצאות חיוביות כוזבות. לדוגמה, האות ניאון ניתן מחדש על ידי שני שברים GFP מסודרים ככל 7 ננומטר אחד מהשני בגלל קרוב אריזה בתא subcellular קטן, אלא כי בשל אינטראקציות ספציפיות 7.
בשל מגבלות אלה, התוצאות שהתקבלו טכנולוגיות הדמיה תא חי חייבת להיות מאושרת על ידי גישה עצמאית מבוססת על עיקרון שונה לאיתור אינטראקציות חלבון. Co-immunoprecipitation (Co-IP) או גלוטתיון transferase (GST) הנפתח מבחני מייצגים שיטות חלופיות כאלה משמשים בדרך כלל כדי לנתח אינטראקציות בין חלבונים במבחנה. עם זאת, אלה מבחני iIn, לעומת זאת, חלבונים נבדק חייב להיות מסיס בקלות למאגר כי supportsused עבור התגובה מחייב. לכן, אינטראקציות ספציפיות הקשורות חלבון מסיס לא ניתן להעריך על ידי טכניקות אלה.
כאן, אנו ממחישים את פרוטוקול עבור assay שכבת קרום חלבון מחייב, אשר עוקף את הקושי הזה. בטכניקה זו, האינטראקציה בין חלבונים מסיסים ובחלקם לא מסיסים ניתן לבדוק באופן מהימן כי אחד החלבונים היא משותקת על מטריצה הממברנה. שיטה זו, בשילוב עם בניסויים vivo, כגון BiFC, מספק גישה אמינה לחקור ולאפיין בנאמנות אינטראקציות בין חלבונים מסיסים ובחלקם לא מסיסים. במאמר זה, מחייב בין נגיף פסיפס הטבק (TMV) חלבון תנועה (MP), אשר מפעילה פונקציות מרובות במהלך ההובלה התא אל התא ויראלי 8-14, וכן interactor צמח זיהו לאחרונה הסלולר, טבק ankyrin לחזור המכילים חלבון (ANK ) 15, מודגמת באמצעות טכניקה זו.
Protocol
Discussion
גישה זו מתאימה בדיקות חלבונים אינטראקציות בין שילובים של חלבונים, כאשר לפחות אחד מהם החלבונים הוא מסיס בקלות למאגר מחייב, והוא מיושם בהצלחה שילוב של חלבונים אחרים 17,18. IInteractions בין חלבונים כי הן מסיס בתנאים אלה לא ניתן לבדוק על ידי פרוטוקול זה.
<p class="jove_content" style="…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
העבודה במעבדה שלנו הוא נתמך על ידי מענקים מ-NIH, המכון הלאומי של משרד החקלאות המזון והחקלאות, NSF, בארד, DOE, ו BSF ל VC
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number |
| Protein assay kit | Bio-Rad | 500-0001 |
| Proteinase inhibitor cocktail | SIGMA | S8820 |
| Mini-PROTEAN system | Bio-RAD | 165-8000 |
| Semi-dry western blotting SD electrotransfer system | Bio-RAD | 170-3940 |
| Anti-rabbit IgG antibody conjugated with horse radish peroxidase | GenScript | A00098 |
| Anti-GST rabbit polyclonal antibody | GenScript | A00097 |
| Anti-strepII | GenScript | A00626 |
| BioTrace, NT nitrocellulose transfer membrane | Pall Scientific | 27377-000 |
| Immobilon western chemiluminescent HRP substrate | Millipore | WBKL S0 050 |
References
- Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation. Mol Cell. 9, 789-798 (2002).
- Citovsky, V. Subcellular localization of interacting proteins by bimolecular fluorescence complementation in planta. J Mol Biol. 362, 1120-1131 (2006).
- Kerppola, T. K. Design and implementation of bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays for the visualization of protein interactions in living cells. Nat Protoc. 1, 1278-1286 (2006).
- Shyu, Y. J. Visualization of protein interactions in living Caenorhabditis elegans using bimolecular fluorescence complementation analysis. Nat Protoc. 3, 588-596 (2008).
- Citovsky, V., Gafni, Y., Tzfira, T. Localizing protein-protein interactions by bimolecular fluorescence complementation in planta. Methods. 45, 196-206 (2008).
- Ohad, N., Shichrur, K., Yalovsky, S. The analysis of protein-protein interactions in plants by bimolecular fluorescence complementation. Plant Physiol. 145, 1090-1099 (2007).
- Zamyatnin, A. A. Assessment of the integral membrane protein topology in living cells. Plant J. 46, 145-154 (2006).
- Citovsky, V., Knorr, D., Schuster, G., Zambryski, P. C. The P30 movement protein of tobacco mosaic virus is a single-strand nucleic acid binding protein. Cell. 60, 637-647 (1990).
- Heinlein, M., Epel, B. L., Padgett, H. S., Beachy, R. N. Interaction of tobamovirus movement proteins with the plant cytoskeleton. Science. 270, 1983-1985 (1995).
- Tomenius, K., Clapham, D., Meshi, T. Localization by immunogold cytochemistry of the virus coded 30 K protein in plasmodesmata of leaves infected with tobacco mosaic virus. Virology. 160, 363-371 (1987).
- Ding, B. Secondary plasmodesmata are specific sites of localization of the tobacco mosaic virus movement protein in transgenic tobacco plants. Plant Cell. 4, 915-928 (1992).
- Meshi, T. Function of the 30 kd protein of tobacco mosaic virus: involvement in cell-to-cell movement and dispensability for replication. EMBO J. 6, 2557-2563 (1987).
- Wolf, S., Deom, C. M., Beachy, R. N., Lucas, W. J. Movement protein of tobacco mosaic virus modifies plasmodesmatal size exclusion limit. Science. 246, 377-379 (1989).
- Waigmann, E., Lucas, W. J., Citovsky, V., Zambryski, P. C. Direct functional assay for tobacco mosaic virus cell-to-cell movement protein and identification of a domain involved in increasing plasmodesmal permeability. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91, 1433-1437 (1994).
- Ueki, S., Spektor, R., Natale, D. M., Citovsky, V. ANK, a host cytoplasmic receptor for the Tobacco mosaic virus cell-to-cell movement protein, facilitates intercellular transport through plasmodesmata. PLoS Pathog. 6, e1001201-e1001201 (2010).
- Coligan, J. E., Dunn, B. M., Ploegh, H. L., Speicher, D. W., Wingfield, P. T., Taylor, G. . , (2011).
- Tzfira, T., Vaidya, M., Citovsky, V. VIP1, an Arabidopsis protein that interacts with Agrobacterium VirE2, is involved in VirE2 nuclear import and Agrobacterium infectivity. EMBO J. 20, 3596-3607 (2001).
- Chen, M. H., Sheng, J., Hind, G., Handa, A., Citovsky, V. Interaction between the tobacco mosaic virus movement protein and host cell pectin methylesterases is required for viral cell-to-cell movement. EMBO J. 19, 913-920 (2000).
