Proteine di membrana Overlay saggio: un protocollo di prova interazione tra proteine solubili e insolubili In vitro</em
Summary
Test interazione proteina-proteina è indispensabile per la dissezione di funzionalità delle proteine. Qui, introdurre un<em> In vitro</em> Proteina-proteina saggio vincolante per sondare una membrana-proteina immobilizzato con una proteina solubile. Questa analisi fornisce un metodo affidabile per verificare l'interazione tra una proteina insolubile e una proteina in soluzione.
Abstract
Convalida interazioni tra proteine diverse è fondamentale per l'esame delle loro funzioni biologiche a livello molecolare. Ci sono diversi metodi, sia in vitro che in vivo, per valutare legame con le proteine, e almeno due metodi che integrano le carenze di ogni altro dovrebbe essere condotta di acquisire le conoscenze affidabili.
Per un test in vivo, la complementazione bimolecolare fluorescenza (BiFC) saggio rappresenta l'approccio più popolare e meno invasivo che permette di rilevare l'interazione proteina-proteina all'interno delle cellule viventi, così come individuare la localizzazione intracellulare del 1,2 interagendo proteine. In questo saggio, non fluorescente metà N-e C-terminale della GFP o di sue varianti si fondono alle proteine testate, e quando le due proteine di fusione sono riuniti a causa delle interazioni delle proteine testate ', il segnale fluorescente viene ricostituito 3-6 . Perché il suo segnale è facilmente rilevabile mediante microscopia in epifluorescenza e confocale, BiFC è emersa come un potente strumento di scelta tra i biologi cellulari per lo studio di interazioni proteina-proteina nelle cellule viventi 3. Questo test, tuttavia, possono a volte produrre risultati falsi positivi. Per esempio, il segnale fluorescente può essere ricostituito da due frammenti GFP disposte, per quanto 7 nm l'una dall'altra a causa di chiudere imballaggio in un piccolo vano subcellulare, piuttosto che a causa di interazioni specifiche 7.
A causa di queste limitazioni, i risultati ottenuti dalle tecnologie di imaging cellulare dal vivo deve essere confermata da un approccio indipendente, basato su un principio diverso per rilevare le interazioni delle proteine. Co-immunoprecipitazione (Co-IP) o glutatione transferasi (GST) pull-down test rappresentano tali metodi alternativi che sono comunemente utilizzati per analizzare interazioni proteina-proteina in vitro. Tuttavia, iIn questi test, però, le proteine testato deve essere facilmente solubile nel buffer che supportsused per la reazione di legame. Pertanto, le interazioni specifiche che coinvolgono una proteina insolubile che non può essere valutata da queste tecniche.
Qui, ci illustrano il protocollo per il saggio sovrapposizione proteina di membrana vincolante, che aggira questa difficoltà. In questa tecnica, l'interazione tra proteine solubili e insolubili in modo attendibile testato perché una delle proteine è immobilizzato su una matrice di membrana. Questo metodo, in combinazione con esperimenti in vivo, come BiFC, fornisce un approccio affidabile per studiare e caratterizzare le interazioni tra fedelmente proteine solubili e insolubili. In questo articolo, vincolante tra virus del mosaico del tabacco (TMV) proteina movimento (MP), che esercita funzioni multiple durante virale cellula-cellula trasporto 8-14, e un impianto di Interactor recentemente identificato cellulari, tabacco ankyrin ripetuta contenenti proteine (ANK ) 15, si dimostra con questa tecnica.
Protocol
Discussion
Questo approccio è adatto per testare interazioni proteina-proteina tra le combinazioni di proteine, quando almeno uno dei quali le proteine è facilmente solubile nel buffer vincolante, ed è stato applicato con successo ad altra combinazione di proteine 17,18. Il iInteractions tra le proteine che sono sia insolubile in queste condizioni non possono essere testati da questo protocollo.
Inoltre, il successo di ripiegamento ProIM è fondamentale per l'analisi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il lavoro nel nostro laboratorio è sostenuto anche da finanziamenti del NIH, USDA Istituto Nazionale di Alimentazione e l'Agricoltura, NSF, BARD, DOE, e BSF a VC
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number |
| Protein assay kit | Bio-Rad | 500-0001 |
| Proteinase inhibitor cocktail | SIGMA | S8820 |
| Mini-PROTEAN system | Bio-RAD | 165-8000 |
| Semi-dry western blotting SD electrotransfer system | Bio-RAD | 170-3940 |
| Anti-rabbit IgG antibody conjugated with horse radish peroxidase | GenScript | A00098 |
| Anti-GST rabbit polyclonal antibody | GenScript | A00097 |
| Anti-strepII | GenScript | A00626 |
| BioTrace, NT nitrocellulose transfer membrane | Pall Scientific | 27377-000 |
| Immobilon western chemiluminescent HRP substrate | Millipore | WBKL S0 050 |
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