蛋白膜覆盖含量：一个协议测试可溶性和不溶性蛋白质之间的相互作用在体外</em
Summary
测试是必不可少的蛋白质 – 蛋白质相互作用蛋白质功能的夹层。在这里，我们引入<em>在体外</em>蛋白质 – 蛋白质结合检测探头与可溶性蛋白的膜固定蛋白质。这个实验提供了一个可靠的方法来测试不溶性蛋白质在溶液中的蛋白质之间的相互作用。
Abstract
验证不同的蛋白质之间的相互作用是至关重要的，为在分子水平上的生物学功能的调查。有几种方法， 在体外和体内 ，以评估蛋白结合，并应进行至少有两种方法，相互补充的缺点，以获得可靠的见解。
对于一个在体内实验中，双分子荧光互补（附设）检测最流行 的，至少侵入的方法，使检测活细胞内蛋白质相互作用，以及识别细胞内相互作用的蛋白质1,2的本地化。在这个实验中，测试蛋白质融合GFP或它的变种N -和C -末端非荧光半，两个融合蛋白汇聚由于测试的蛋白质“相互作用时，荧光信号是重组 3-6 。因为它的信号很容易epifluorescence或共聚焦显微镜检测，附设已经成为一个强大的工具，在活细胞3中蛋白质相互作用的研究细胞生物学家之间的选择。然而，这个实验中，有时会产生假阳性结果。例如，荧光信号可以安排尽可能远离对方因7纳米包装在一个小的亚细胞车厢关闭两个GFP片段重组，而由于特定的相互作用 7 。
由于这些限制，从活细胞成像技术所取得的成果，应确认由一个独立的方法的基础上，检测蛋白质相互作用的原理不同。免疫共（联合IP）或谷胱甘肽转移酶（GST）的代表等，通常用于分析蛋白质相互作用，在体外Pull – down实验的替代方法。然而，IIN这些实验，然而，测试的蛋白质一定要容易溶于supportsused结合反应的缓冲区。因此，具体涉及一种不溶性蛋白质的相互作用，不能由这些技术进行评估。
在这里，我们说明了蛋白质膜覆盖结合试验，从而绕过这个困难的协议。在这种技术中，可以可靠地测试可溶性和不溶性蛋白质之间的相互作用，因为固定在膜基质的蛋白质之一。这种方法， 在体内实验，如附设结合，提供了一个可靠的方法，调查和定性可溶性和不溶性蛋白质之间的相互作用忠实。在这篇文章中，烟草花叶病毒（TMV）之间具有约束力的运动蛋白（MP），发挥多种功能，在病毒的细胞与细胞之间的运输8-14，以及最近发现植物细胞interactor，烟草含有锚蛋白重复蛋白（ANK 15），证明使用这种技术。
Protocol
Discussion
这种方法适用于检测蛋白质相互作用的蛋白质之间的组合，当至少有一个，其中的蛋白质很容易结合缓冲液中的可溶性，并成功地应用到其他结合蛋白17,18。不能测试都是在这些条件下的不溶性蛋白质之间的iInteractions本议定书。
此外，ProIM成功复性检测的关键。漂洗后的electrotransfer在TBS的膜是关键的一步，因为残留的SDS损害变性/复性过程。
最后?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
在我们的实验室的工作是从国立卫生研究院，美国农业部国家粮食和农业研究所，国家科学基金会，巴德，能源部和BSF拨款到VC支持
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number |
| Protein assay kit | Bio-Rad | 500-0001 |
| Proteinase inhibitor cocktail | SIGMA | S8820 |
| Mini-PROTEAN system | Bio-RAD | 165-8000 |
| Semi-dry western blotting SD electrotransfer system | Bio-RAD | 170-3940 |
| Anti-rabbit IgG antibody conjugated with horse radish peroxidase | GenScript | A00098 |
| Anti-GST rabbit polyclonal antibody | GenScript | A00097 |
| Anti-strepII | GenScript | A00626 |
| BioTrace, NT nitrocellulose transfer membrane | Pall Scientific | 27377-000 |
| Immobilon western chemiluminescent HRP substrate | Millipore | WBKL S0 050 |
References
- Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation. Mol Cell. 9, 789-798 (2002).
- Citovsky, V. Subcellular localization of interacting proteins by bimolecular fluorescence complementation in planta. J Mol Biol. 362, 1120-1131 (2006).
- Kerppola, T. K. Design and implementation of bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays for the visualization of protein interactions in living cells. Nat Protoc. 1, 1278-1286 (2006).
- Shyu, Y. J. Visualization of protein interactions in living Caenorhabditis elegans using bimolecular fluorescence complementation analysis. Nat Protoc. 3, 588-596 (2008).
- Citovsky, V., Gafni, Y., Tzfira, T. Localizing protein-protein interactions by bimolecular fluorescence complementation in planta. Methods. 45, 196-206 (2008).
- Ohad, N., Shichrur, K., Yalovsky, S. The analysis of protein-protein interactions in plants by bimolecular fluorescence complementation. Plant Physiol. 145, 1090-1099 (2007).
- Zamyatnin, A. A. Assessment of the integral membrane protein topology in living cells. Plant J. 46, 145-154 (2006).
- Citovsky, V., Knorr, D., Schuster, G., Zambryski, P. C. The P30 movement protein of tobacco mosaic virus is a single-strand nucleic acid binding protein. Cell. 60, 637-647 (1990).
- Heinlein, M., Epel, B. L., Padgett, H. S., Beachy, R. N. Interaction of tobamovirus movement proteins with the plant cytoskeleton. Science. 270, 1983-1985 (1995).
- Tomenius, K., Clapham, D., Meshi, T. Localization by immunogold cytochemistry of the virus coded 30 K protein in plasmodesmata of leaves infected with tobacco mosaic virus. Virology. 160, 363-371 (1987).
- Ding, B. Secondary plasmodesmata are specific sites of localization of the tobacco mosaic virus movement protein in transgenic tobacco plants. Plant Cell. 4, 915-928 (1992).
- Meshi, T. Function of the 30 kd protein of tobacco mosaic virus: involvement in cell-to-cell movement and dispensability for replication. EMBO J. 6, 2557-2563 (1987).
- Wolf, S., Deom, C. M., Beachy, R. N., Lucas, W. J. Movement protein of tobacco mosaic virus modifies plasmodesmatal size exclusion limit. Science. 246, 377-379 (1989).
- Waigmann, E., Lucas, W. J., Citovsky, V., Zambryski, P. C. Direct functional assay for tobacco mosaic virus cell-to-cell movement protein and identification of a domain involved in increasing plasmodesmal permeability. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91, 1433-1437 (1994).
- Ueki, S., Spektor, R., Natale, D. M., Citovsky, V. ANK, a host cytoplasmic receptor for the Tobacco mosaic virus cell-to-cell movement protein, facilitates intercellular transport through plasmodesmata. PLoS Pathog. 6, e1001201-e1001201 (2010).
- Coligan, J. E., Dunn, B. M., Ploegh, H. L., Speicher, D. W., Wingfield, P. T., Taylor, G. . , (2011).
- Tzfira, T., Vaidya, M., Citovsky, V. VIP1, an Arabidopsis protein that interacts with Agrobacterium VirE2, is involved in VirE2 nuclear import and Agrobacterium infectivity. EMBO J. 20, 3596-3607 (2001).
- Chen, M. H., Sheng, J., Hind, G., Handa, A., Citovsky, V. Interaction between the tobacco mosaic virus movement protein and host cell pectin methylesterases is required for viral cell-to-cell movement. EMBO J. 19, 913-920 (2000).
