التحقيق الخارجي على الحركة خلية الشعر مع مزيج من التحفيز الخارجي المتردد مجال كهربائي عالي السرعة وتحليل الصور
Summary
ووصف طريقة موثوقة للتحقيق في الخلية الخارجي الشعر (OHC) ردود متحركة ، بما في ذلك electromotility ، حركية بطيئة والانحناء. وأثارت OHC حركية بواسطة التحفيز مع حقل خارجي الكهربائية بالتناوب ، وطريقة الاستفادة من تسجيل صورة عالية السرعة ، وإنارة LED مقرها ، ومشاركة برنامج تحليل الصور جيل.
Abstract
OHCs هي اسطوانية الخلايا الحسية الموجودة في الجهاز كورتي ، الجهاز السمعي داخل الأذن الداخلية الثدييات. اسم "خلايا الشعر" مستمد من حزمة من قمية المميزة لأهداب ساكنة ، عنصرا حاسما لكشف وتنبيغ من الطاقة السليمة 1. OHCs قادرة على تغيير شكلها ، استطال ، وتقصير ، وثني ، وذلك استجابة لتحفيز الكهربائية والميكانيكية والكيميائية ، واستجابة الحركية التي تعتبر حاسمة لتضخيم قوقعة من الإشارات الصوتية 2.
OHC التحفيز يدفع ردين متحركة مختلفة : ط) electromotility ، الملقب حركية سريعة ، والتغيرات في الطول في نطاق ميكروثانية المستمدة من كهربائيا يحركها التغييرات متعلق بتكوين البروتينات في السيارات المزدحمة بالسكان في غشاء البلازما OHC ، والثاني) حركية بطيئة ، والتغييرات في الشكل ميلي ثانية واحدة إلى مجموعة ثانية تشمل إعادة تنظيم هيكل الخلية 2 ، 3. ويرتبط مع electromotility OHC الانحناء ، وإما نتيجة التوزيع غير المتماثل من البروتينات السيارات في غشاء البلازما الوحشي ، أو التحفيز الكهربائي غير متكافئة من تلك البروتينات السيارات (على سبيل المثال ، مع مجال كهربائي عمودي على محور طويل من الخلايا) 4. المحفزات الميكانيكية والكيميائية تحفز الاستجابات بطيئة متحركة أساسا ، على الرغم من التغيرات في الظروف الأيونية للخلايا و / أو بيئتها يمكن أن تحفز أيضا جزءا لا يتجزأ من غشاء البلازما البروتينات السيارات 5 ، 6. منذ الاستجابات OHC متحركة تشكل عنصرا أساسيا من مكبر للصوت القوقعة ، والتحليل النوعي والكمي لهذه الاستجابات على ترددات صوتية متحركة (حوالي من 20 هرتز إلى 20 كيلو هرتز في البشر) هو أمر مهم جدا في مجال البحوث جلسة 7.
تطوير تكنولوجيا جديدة تجمع بين التصوير عالية السرعة videocameras ، وأنظمة الإضاءة LED ومقرها ومتطورة توفر برمجيات تحليل الصور الآن القدرة على أداء موثوق بها ونوعية الدراسات الكمية للاستجابة متحركة للOHCs المعزولة إلى حقل كهربائي خارجي بالتناوب (EAEF) 8. هذا هو أسلوب بسيط وغير الغازية التي تلتف معظم القيود المفروضة على النهج السابق 9-11. وعلاوة على ذلك ، ونظام إضاءة LED المستندة يوفر السطوع الشديد مع آثار ضئيلة الحرارية على عينات ، وبسبب استخدام الفحص المجهري للفيديو ، القرار الضوئية لا يقل عن 10 أضعاف أعلى مما مع التقنيات التقليدية المجهري الخفيفة 12. على سبيل المثال ، مع الإعداد التجريبية وصفها هنا ، يمكن للتغيرات في طول خلية من حوالي 20 نانومتر ، وبشكل روتيني يتم الكشف بشكل صحيح على الترددات من 10 كيلوهرتز ، ويمكن أن يكون هذا القرار مزيدا من التحسن في ترددات منخفضة نسبيا.
نحن واثقون من أن هذا النهج التجريبي سوف تساعد على توسيع فهمنا للآليات الخلوية والجزيئية الكامنة وراء OHC حركية.
Protocol
Discussion
المنهج التجريبي المقدمة هنا يمكن تقدير ردود OHC متحركة في نطاق كيلوهرتز دون أي قيود على حركة الخلية. بروتوكولات تنبيه مختلفة ، وعلامات إضافية (المجهرية) ، وكذلك التغيرات في اتجاه الخلية فيما يتعلق الحقل الكهربائي ، وجعل من الممكن تحقيق جوانب جديدة من حركية OHC مع مستوى ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
العمل بدعم من المعاهد الوطنية للصحة منح R01DC10146/R01DC010397 ، P30 NIDCD الأساسية DC006276 بحوث والتعليم العالي. محتواه هو فقط من مسؤولية الكتاب ولا تمثل بالضرورة وجهة نظر رسمية من المعاهد الوطنية للصحة أو التعليم العالي. الكتاب تعلن أي نزاع قائم أو محتمل في المصالح.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Leibovitz’s L-15 | Gibco | 21083 | |
| Collagenase (Type 4) | Sigma-Aldrich | C5138 | 1mg/mL in L-15 |
References
- Frolenkov, G. I. Genetic insights into the morphogenesis of inner ear hair cells. Nat Rev Genet. 5, 489-498 (2004).
- Ashmore, J. Cochlear outer hair cell motility. Physiol Rev. 88, 173-210 (2008).
- Dallos, P., Fakler, B. Prestin, a new type of motor protein. Nature Rev. Mol. Cell Biol. 3, 104-111 (2002).
- Frolenkov, G. I. Cochlear outer hair cell bending in an external electrical field. Biophys. J. 73, 1665-1672 (1997).
- Matsumoto, N., Kalinec, F. Extraction of Prestin-Dependent and Prestin-Independent Components from Complex Motile Responses in Guinea Pig Outer Hair Cells. Biophys J. 89, 4343-4351 (2005).
- Matsumoto, N., Kalinec, F. Prestin-dependent and prestin-independent motility of guinea pig outer hair cells. Hear Res. 208, 1-12 (2005).
- Ashmore, J. The remarkable cochlear amplifier. Hear Res. 266, 1-17 (2010).
- Kitani, R., Kakehata, S., Kalinec, F. Motile responses of cochlear outer hair cells stimulated with an alternating electrical field. Hearing Research. , (2011).
- Dallos, P., Evans, B. N. High-frequency outer hair cell motility: corrections and addendum. Science. 268, 1420-1421 (1995).
- Frank, G., Hemmert, W., Gummer, A. W. Limiting dynamics of high-frequency electromechanical transduction in outer hair cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 96, 4420-4425 (1999).
- Santos-Sacchi, J. On the frequency limit and phase of outer hair cell motility: effects of the membrane filter. J. Neurosci. 12, 1906-1916 (1992).
- Inoué, S. . Video Microscopy. , (1986).
