Onderzoeken van buitenste haarcel beweeglijkheid met een combinatie van externe Alternating elektrisch veld Stimulatie en High-speed Image Analysis

Summary

Een betrouwbare methode om buiten haar cel (OHC) beweeglijke reacties, waaronder electromotility, trage motiliteit en buigen, te onderzoeken is beschreven. OHC beweeglijkheid wordt opgewekt door stimulatie met een externe wisselend elektrisch veld, en de methode maakt gebruik van high-speed foto-opname, op basis van LED-verlichting, en de laatste generatie beeldanalyse-software.

Abstract

OHCS zijn cilindrische sensomotorische cellen in het orgaan van Corti, het gehoororgaan in het binnenoor zoogdieren. De naam "haarcellen" is afgeleid van hun karakteristieke apicale bundel van stereocilia, een cruciaal element voor de detectie en de transductie van geluid energie ^1. OHCS zijn in staat om te veranderen van vorm langwerpig, verkorten en buig-in reactie op de elektrische, mechanische en chemische prikkeling, een motorische respons beschouwd als cruciaal voor cochleaire versterking van akoestische signalen ^2.

OHC stimulatie leidt tot twee verschillende beweeglijke reacties: i) electromotility, alias snel motiliteit, veranderingen in de lengte in de microseconde range afgeleid van elektrisch aangedreven conformationele veranderingen in de motorische eiwitten dicht verpakt in OHC plasmamembraan, en ii) trage beweeglijkheid, vorm veranderingen in de milliseconde tot seconde met gebruikmaking van het cytoskelet reorganisatie ^{2, 3.} OHC buigen wordt geassocieerd met electromotility, en het resultaat ofwel van een asymmetrische verdeling van de motor-eiwitten in de laterale plasmamembraan, of asymmetrische elektrische stimulatie van de motorische eiwitten (bijvoorbeeld met een elektrisch veld loodrecht op de lange as van de cellen) ^4. Mechanische en chemische prikkels veroorzaken in wezen langzaam beweeglijke reacties, ook al veranderingen in de ionische voorwaarden van de cellen en / of hun omgeving kunnen ook de plasmamembraan-embedded motoreiwitten ^{5, 6} stimuleren. Sinds OHC beweeglijk reacties zijn een essentieel onderdeel van de cochleaire versterker, de kwalitatieve en kwantitatieve analyse van deze beweeglijke reacties op akoestische frequenties (ruwweg van 20 Hz tot 20 kHz bij de mens) is een zeer belangrijke zaak op het gebied van het gehoor onderzoek ^7.

De ontwikkeling van nieuwe imaging technologie combineert high-speed videocamera's, LED-verlichting op basis van systemen, en geavanceerde beeldanalyse-software biedt nu de mogelijkheid om een ​​betrouwbare kwalitatieve en kwantitatieve studies van de beweeglijke reactie van geïsoleerde OHCS uit te voeren om een ​​extern wisselend elektrisch veld (EAEF) ^8. Dit is een eenvoudige en niet-invasieve techniek die het grootste deel van de beperkingen van eerdere benaderingen ^9-11 omzeilt. Bovendien is de LED-verlichting op basis van systeem biedt extreme helderheid met een te verwaarlozen thermische effecten op de monsters en, als gevolg van het gebruik van video-microscopie, optische resolutie is minstens 10 maal hoger dan bij conventionele lichtmicroscopie technieken ^12. Bijvoorbeeld met de experimentele opstelling hier beschreven, kunnen veranderingen in cel lengte van ongeveer 20 nm routinematig en betrouwbaar gedetecteerd bij een frequentie van 10 kHz, en deze resolutie verder verbeterd kan worden bij lagere frequenties.

We zijn ervan overtuigd dat deze experimentele aanpak zal bijdragen aan ons begrip van de cellulaire en moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen OHC motiliteit uit te breiden.

Protocol

1. Isolatie van OHCS Begin deze procedure door het oogsten van tijdelijke botten van cavia's, muizen of uw zoogdieren diermodel. Open vervolgens de tijdelijke botten met behulp van een hamer tang om het slakkenhuis bloot te leggen, en dompel hen in Leibovitz L-15. Verwijder voorzichtig het bot teveel, waardoor de benige omhulsel intact. Overwegende dat dit een algemene procedure van toepassing is op tijdelijke beenderen van een zoogdiersoort, kunnen er kleine wijzigingen aan de techniek noodzake…

Discussion

De experimentele methode hier beschreven staat schatten OHC beweeglijk reacties in het kHz bereik zonder enige beperking om beweging van de cel. Verschillende stimulatie protocollen, extra markers (microbolletjes), maar ook veranderingen in de oriëntatie van de cel met betrekking tot het elektrische veld, maken het mogelijk om nieuwe aspecten van de OHC beweeglijkheid onderzocht met een niveau van detail voorheen ontoegankelijk. Andere methoden, bijvoorbeeld die met behulp van fotodiodes ⁹ of laser Doppler v…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Leibovitz’s L-15	Gibco	21083
Collagenase (Type 4)	Sigma-Aldrich	C5138	1mg/mL in L-15