Die Untersuchung der äußeren Haarzellen Motilität mit einer Kombination von externen elektrischen Wechselfeld Stimulation und High-Speed-Image Analysis
Summary
Eine zuverlässige Methode, um der äußeren Haarzellen (OHC) beweglich Reaktionen, einschließlich Elektromotilität, langsame Motilität und Biegen, untersuchen beschrieben. OHC Motilität wird durch die Stimulation mit einem externen elektrischen Wechselfeld, und die Methode nutzt die Highspeed-Aufnahme, LED-Beleuchtung, und die letzte Generation Bildanalyse-Software.
Abstract
OHCs sind zylindrisch sensomotorischen Zellen im Corti-Organ, das Hörorgan im Inneren des Säuger-Innenohrs befindet. Der Name "Haarzellen" leitet sich von ihrer charakteristischen apikalen Bündel von Stereozilien, ein entscheidendes Element für die Detektion und Transduktion von Schallenergie 1. OHCs der Lage sind, verändern ihre Form-länglich, zu verkürzen und biegen in Reaktion auf elektrische, mechanische und chemische Stimulation, als eine motorische Reaktion entscheidend für Cochlea Verstärkung der akustischen Signale 2.
OHC Stimulation induziert zwei verschiedene bewegliche Antworten: i) Elektromotilität, auch bekannt als schnelle Motilität, Veränderungen in der Länge im Bereich von Mikrosekunden von elektrisch angetriebenen Konformationsänderungen in Motorproteine dicht in OHC Plasmamembran verpackt abgeleitet, und ii) langsam Beweglichkeit, Form Veränderungen in der Millisekunde bis Sekundenbereich mit Zytoskelett-Reorganisation 2, 3. OHC Biegen ist mit Elektromotilität verbunden sind, und das Ergebnis entweder von einer asymmetrischen Verteilung der Motorproteine in den seitlichen Plasmamembran, oder asymmetrische elektrische Stimulation dieser Motorproteine (zB mit einem elektrischen Feld senkrecht zur Längsachse der Zellen) 4. Mechanische und chemische Reize auslösen Wesentlichen langsam bewegliche Antworten, auch wenn Veränderungen in der ionischen Bedingungen der Zellen und / oder deren Umgebung kann auch Impulse für die Plasmamembran-embedded Motorproteine 5, 6. Da OHC bewegliche Antworten ein wesentlicher Bestandteil des cochleären Verstärkers, die qualitative und quantitative Analyse dieser beweglichen Reaktionen auf akustische Frequenzen (etwa von 20 Hz bis 20 kHz beim Menschen) sind, ist ein sehr wichtiges Thema im Bereich des Hörens Forschung 7.
Die Entwicklung neuer Imaging-Technologie kombiniert Hochgeschwindigkeits-Videokameras, LED-basierten Beleuchtungssystemen und ausgefeilte Bildanalyse-Software bietet nun die Möglichkeit, zuverlässige qualitative und quantitative Untersuchungen der beweglichen Reaktion von isolierten OHCs an ein externes elektrisches Wechselfeld (EAEF) durchführen 8. Dies ist eine einfache und nicht-invasive Technik, die die meisten der Grenzen der bisherigen Ansätze 9-11 umgeht. Darüber hinaus bietet die LED-basierte Beleuchtung System extreme Helligkeit mit unbedeutenden thermischen Auswirkungen auf die Proben und wegen der Verwendung von Video-Mikroskopie, ist die optische Auflösung mindestens 10-fach höher als bei konventionellen Lichtmikroskopie Techniken 12. Zum Beispiel mit dem Versuchsaufbau hier beschrieben, können Veränderungen in der Zelle Länge von etwa 20 nm routinemäßig und zuverlässig bei Frequenzen von 10 kHz erfasst, und diese Auflösung kann bei niedrigeren Frequenzen verbessert werden.
Wir sind zuversichtlich, dass dieser experimentelle Ansatz wird dazu beitragen, unser Verständnis der zellulären und molekularen Mechanismen, die OHC Beweglichkeit zu erweitern.
Protocol
Discussion
Die experimentelle Methode hier vorgestellten ermöglicht die Schätzung OHC motile Reaktionen in den kHz-Bereich ohne Einschränkung auf die Zelle der Bewegung. Verschiedene Stimulationsprotokolle, zusätzliche Markierungen (Mikrosphären), sowie Veränderungen in der Ausrichtung der Zelle in Bezug auf das elektrische Feld, machen es möglich, neue Aspekte der OHC Motilität mit einer Detailgenauigkeit bisher unzugänglichen untersuchen. Andere Methoden, z. B. die Verwendung von Fotodioden 9 oder Laser-Doppl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Arbeit unterstützt von den National Institutes of Health Grants R01DC10146/R01DC010397, NIDCD P30 DC006276 Forschung Core und HEI. Sein Inhalt ist ausschließlich die Verantwortung der Autoren und stellen nicht notwendigerweise die offizielle Meinung des NIH oder HEI. Die Autoren erklären, keine bestehenden oder potenziellen Interessenkonflikt.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Leibovitz’s L-15 | Gibco | 21083 | |
| Collagenase (Type 4) | Sigma-Aldrich | C5138 | 1mg/mL in L-15 |
References
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