We presenteren twee onafhankelijke, microscoop-gebaseerde tools om de veroorzaakte nucleaire en cytoskelet vervormingen in enkele, levende hechtende cellen te meten in reactie op globale of lokale stam toepassing. Deze technieken worden gebruikt om de nucleaire stijfheid (dat wil zeggen, vervormbaarheid) te bepalen en om intracellulaire krachtoverbrenging tussen de kern en het cytoskelet sonde.
In de meeste eukaryotische cellen, de kern is de grootste organel en is meestal 2 tot 10 keer stijver dan de omringende cytoskelet, bijgevolg, de fysische eigenschappen van de kern belangrijke mate bijdragen aan de algehele biomechanische gedrag van cellen onder fysiologische en pathologische omstandigheden. Bijvoorbeeld bij het migreren van neutrofielen en binnendringende kankercellen, de nucleaire stijfheid kan een groot obstakel vormen bij extravasatie of passage door smalle ruimtes binnen weefsels. 1 Aan de andere kant, de kern van cellen in mechanisch actief weefsel zoals spier vereist voldoende structurele steun aan bestand tegen herhaalde mechanische belasting. Belangrijk is dat de kern nauw geïntegreerd in de cellulaire architectuur, het is fysiek verbonden met de omliggende cytoskelet, dat is een kritische voorwaarde voor de intracellulaire beweging en positionering van de kern, bijvoorbeeld in gepolariseerde cellen, synaptische kernen op neuromusculaire verbindingen, of in migrerende cellen. 2 is niet verrassend, mutaties in de nucleaire enveloppe eiwitten zoals lamins en nesprins, die een kritische rol spelen bij het bepalen van de nucleaire stijfheid en nucleo-cytoskeletale koppeling, zijn onlangs resulteerde in een aantal menselijke ziekten, waaronder Emery- Dreifuss spierdystrofie, limb-girdle spierdystrofie, en gedilateerde cardiomyopathie. 3 Om de biofysische functie van diverse nucleaire envelop eiwitten en het effect van specifieke mutaties te onderzoeken, hebben we experimentele methoden om de fysische eigenschappen van de kern studie in enkele, levende cellen onderworpen aan globale of lokale mechanische storing. Het meten van geïnduceerde nucleaire vervormingen in reactie op precies toegepast ondergrond stam toepassing levert belangrijke informatie over de vervormbaarheid van de kern en maakt kwantitatieve vergelijking tussen verschillende mutaties of cellijnen die deficiënt zijn voor specifieke nucleaire envelope eiwitten. Gelokaliseerde cytoskelet stam applicatie met een microneedle wordt gebruikt om deze test te vullen en kan aanvullende informatie opleveren over intracellulaire krachtoverbrenging tussen de kern en het cytoskelet. Studeren nucleaire mechanica in intacte levende cellen behoudt zich het normale intracellulaire architectuur en vermijdt mogelijke artefacten die kunnen ontstaan bij het werken met geïsoleerde kernen. Bovendien ondergrond stam toepassing presenteert een goed model voor de fysiologische stress ervaren door cellen in de spieren of andere weefsels (bijvoorbeeld vasculaire gladde spiercellen blootgesteld aan schip-stam). Ten slotte, terwijl deze tools zijn primair ontwikkeld om nucleaire mechanische studie, kunnen ze ook worden toegepast op de functie van cytoskeleteiwitten en mechanotransductie signalering te onderzoeken.
Substraat stam assay
Stam aanvraag is met succes gebruikt door ons en andere groepen om geïnduceerde nucleaire vervormingen in de cellen blootgesteld aan mechanische belasting te bestuderen en om de bijdrage van specifieke nucleaire envelop-eiwitten te onderzoeken nucleaire stijfheid. 4-8 Het voordeel van deze techniek is dat het sondes mechanische eigenschappen van het leven kernen in hun normale cellulaire en cytoskeletale milieu en dat de ondergrond stam applicatie lijkt op de fy…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health (R01 HL082792 en R01 NS059348) en het Brigham and Women's Hospital Cardiovascular Leadership Group Award.
Name of Reagent | Company | Catalogue number |
Fibronectin | Millipore | FC010 |
MitoTracker Red FM and Green FM | Invitrogen | M22425 and M-7514 |
Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 |
Hank’s Buffered Salt Saline | Invitrogen | 14185 |
Phenol free, DMEM | Invitrogen | 21063 |
Fetal bovine serum | Aleken Biologicals | FBSS500 |
Penicillin/Streptomycin | Sigma | P0781-100ML |
Borosilicate Glass with filament | Sutter Instrument | BF100-78-10 |
Gloss/Gloss non-reinforced silicone sheeting, 0.005″ | Specialty Manufacturing Inc. | |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Invitrogen | 14200 |
35 mm glass bottom culture dishes (FluoroDish) | World Precision Instruments, INC | FD35-100 |
Braycote 804 Vacuum Grease | Spi supplies | 05133A-AB |