Ensaios biofísicos para investigar as propriedades mecânicas do núcleo da célula Interphase: Aplicação de substrato Strain e Manipulação de microagulhas
Summary
Nós apresentamos dois independentes, microscópio de ferramentas baseadas em medir as deformações induzidas nucleares e citoesqueleto em single, vivendo células aderentes em resposta à aplicação de tensão global ou localizada. Estas técnicas são utilizadas para determinar a rigidez nuclear (ou seja, deformabilidade) e para transmissão de força sonda intracelular entre o núcleo e citoesqueleto.
Abstract
Na maioria das células eucarióticas, o núcleo é a maior organela e é geralmente de 2 a 10 vezes mais duro do que o citoesqueleto redor e, conseqüentemente, as propriedades físicas do núcleo contribuir significativamente para o comportamento global biomecânica de células em condições fisiológicas e patológicas. Por exemplo, na migração de neutrófilos e invadindo as células cancerosas, rigidez nuclear pode representar um grande obstáculo durante o extravasamento ou passagem através de espaços estreitos dentro dos tecidos. 1 Por outro lado, o núcleo de células no tecido mecanicamente ativos, tais como o músculo requer suporte estrutural suficiente para suportar o estresse mecânico repetitivo. Importante, o núcleo é totalmente integrado à arquitetura celular, que está fisicamente ligado ao citoesqueleto circundante, que é um requisito essencial para o movimento intracelular e posicionamento do núcleo, por exemplo, em células polarizadas, núcleos sináptica nas junções neuromusculares, ou em células de migração. 2 Não é de surpreender que mutações em proteínas do envelope nuclear, como lamins e nesprins, que desempenham um papel crítico na determinação da rigidez nuclear e nucleo-citoesqueleto acoplamento, tem sido mostrado recentemente para resultar em uma série de doenças humanas, incluindo Emery- Dreifuss distrofia muscular, cinturas pélvica e escapular distrofia muscular e miocardiopatia dilatada. 3 Para investigar a função de diversas proteínas biofísicos envelope nuclear eo efeito de mutações específicas, desenvolvemos métodos experimentais para estudar as propriedades físicas do núcleo em um único, células vivas submetido a global ou localizada perturbação mecânica. Medição induzidos deformações nucleares em resposta ao pedido precisamente aplicado substrato tensão gera informações importantes sobre a deformabilidade do núcleo e permite a comparação quantitativa entre mutações diferentes ou linhas de células específicas para deficientes proteínas do envelope nuclear. Aplicação esforço localizado citoesqueleto com microagulhas é utilizado para complementar este ensaio e pode fornecer informações adicionais sobre a transmissão de força entre o núcleo intracelular e citoesqueleto. Estudar a mecânica nuclear em células vivas intactas preserva a arquitetura normal intracelular e evita artefatos potenciais que podem surgir quando se trabalha com núcleos isolados. Além disso, a aplicação tensão substrato apresenta um bom modelo para o estresse fisiológico experimentado por células em músculos ou outros tecidos (por exemplo, células musculares lisas vasculares expostos a tensão navio). Por último, enquanto que essas ferramentas têm sido desenvolvidas principalmente para estudar mecânica nuclear, eles também podem ser aplicados para investigar a função das proteínas do citoesqueleto e sinalização Mecanotransdução.
Protocol
Discussion
Ensaio de tensão substrato
Aplicação cepa tem sido usada com sucesso por nós e outros grupos para estudar as deformações induzidas nuclear em células submetidas a estresse mecânico e investigar a contribuição das proteínas específicas envelope nuclear à rigidez nuclear. 08/04 A vantagem desta técnica é que ela sondas propriedades mecânicas núcleos de viver em seu ambiente normal celular e do citoesqueleto e que a aplicação tensão substrato assemelha-se a aplicaç?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health (R01 e R01 HL082792 NS059348) e do Hospital Brigham and Women Award do Grupo de Liderança Cardiovascular.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalogue number |
| Fibronectin | Millipore | FC010 |
| MitoTracker Red FM and Green FM | Invitrogen | M22425 and M-7514 |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 |
| Hank’s Buffered Salt Saline | Invitrogen | 14185 |
| Phenol free, DMEM | Invitrogen | 21063 |
| Fetal bovine serum | Aleken Biologicals | FBSS500 |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | P0781-100ML |
| Borosilicate Glass with filament | Sutter Instrument | BF100-78-10 |
| Gloss/Gloss non-reinforced silicone sheeting, 0.005″ | Specialty Manufacturing Inc. | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Invitrogen | 14200 |
| 35 mm glass bottom culture dishes (FluoroDish) | World Precision Instruments, INC | FD35-100 |
| Braycote 804 Vacuum Grease | Spi supplies | 05133A-AB |
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