מבחני Biophysical לחקור את תכונות מכניות של גרעין התא שלבי הביניים: מסננים תשתית יישומים מניפולציה Microneedle
Summary
אנו מציגים שתי עצמאית, מיקרוסקופ מבוססי כלים למדידת דפורמציות גרעיני cytoskeletal המושרה, תאים בודדים חיים חסיד בתגובה לבקשה מאמץ עולמי או מקומי. טכניקות אלו משמשות כדי לקבוע קשיחות גרעיני (כלומר, deformability) וכן לחקור העברת כוח תאיים בין הגרעין לבין cytoskeleton.
Abstract
בתאים אוקריוטים ביותר, הגרעין הוא אברון הגדול הוא בדרך כלל 2 עד 10 פעמים נוקשה יותר cytoskeleton שמסביב; וכתוצאה מכך, את התכונות הפיסיקליות של גרעין לתרום באופן משמעותי התנהגות ביומכנית הכולל של תאים בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים. לדוגמה, נודדות נויטרופילים הפולשים תאים סרטניים, נוקשות גרעיני יכול להוות מכשול מרכזי במהלך extravasation או מעבר דרך מקומות צרים בתוך רקמות. 1 מצד שני, את הגרעין של תאים ברקמות פעיל מכנית כגון שריר דורש תמיכה מבנית מספיק לעמוד בפני הלחץ המכני חוזרות. חשוב לציין, בגרעין היא משולבת בתוך האדריכלות הסלולר: הוא מחובר פיזית cytoskeleton שמסביב, אשר היא דרישה קריטית עבור התנועה תאיים ומיצוב של הגרעין, למשל, בתאים מקוטב, גרעינים הסינפטי בצמתים neuromuscular, או תאים נודדים. 2 באופן לא מפתיע, מוטציות חלבונים מעטפת הגרעין כגון lamins ו nesprins, אשר לשחק תפקיד קריטי בקביעת קשיחות גרעיני Nucleo-cytoskeletal צימוד, הוכחו לאחרונה תוצאה במספר מחלות אנושיות, כולל שמיר, ניוון שרירים דרייפוס, איבר-המחוך ניוון שרירים, קרדיומיופתיה מורחבים. 3 כדי לחקור את הפונקציה biophysical של מגוון חלבונים מעטפת הגרעין ואת ההשפעה של מוטציות ספציפיות, פיתחנו שיטות ניסיוניות ללמוד את התכונות הפיסיקליות של גרעין ב, תאים בודדים חיים נתון ההפרעות מכני גלובלי או מקומי. מדידת דפורמציות גרעיני הנגרמת בעקבות יישום מיושם דווקא זן המצע התשואות מידע חשוב על deformability של הגרעין ומאפשר השוואה כמותית בין מוטציות שונות או שורות תאים לקוי של חלבונים ספציפיים מעטפת הגרעין. זן מקומי יישום cytoskeletal עם microneedle משמש כדי להשלים את זה assay והוא יכול להניב מידע נוסף על העברת כוח תאיים בין הגרעין לבין cytoskeleton. לימוד המכניקה הגרעין בתאים חיים שלמים משמר את הארכיטקטורה תאיים רגיל ונמנע חפצים פוטנציאליים שיכולים להתעורר בעת עבודה עם גרעינים מבודדים. יתר על כן, זן יישום המצע מציג מודל טוב הלחץ הפיזיולוגי מנוסים על ידי תאים בשריר או ברקמות אחרות (למשל, כלי הדם לתאי שריר חלק חשוף זן כלי שיט). לבסוף, כאשר כלים אלה פותחו בעיקר כדי ללמוד מכניקה גרעיני, הם יכולים להיות מיושם גם לחקור את תפקודם של חלבונים cytoskeletal והאיתות mechanotransduction.
Protocol
Discussion
זן תשתית assay
יישום מסננים שימש בהצלחה על ידינו וקבוצות אחרות ללמוד דפורמציות גרעיני המושרה בתאים נתון ללחץ מכני לחקור את התרומה של חלבונים ספציפיים מעטפת הגרעין כדי נוקשות גרעיני. 4-8 היתרון של שיטה זו היא כי בדיקות תכונות מכנ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מכוני הבריאות הלאומיים (R01 ו R01 HL082792 NS059348) ואת בריגהם לב וכלי דם החולים לנשים מנהיגות פרס הקבוצה.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalogue number |
| Fibronectin | Millipore | FC010 |
| MitoTracker Red FM and Green FM | Invitrogen | M22425 and M-7514 |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 |
| Hank’s Buffered Salt Saline | Invitrogen | 14185 |
| Phenol free, DMEM | Invitrogen | 21063 |
| Fetal bovine serum | Aleken Biologicals | FBSS500 |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | P0781-100ML |
| Borosilicate Glass with filament | Sutter Instrument | BF100-78-10 |
| Gloss/Gloss non-reinforced silicone sheeting, 0.005″ | Specialty Manufacturing Inc. | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Invitrogen | 14200 |
| 35 mm glass bottom culture dishes (FluoroDish) | World Precision Instruments, INC | FD35-100 |
| Braycote 804 Vacuum Grease | Spi supplies | 05133A-AB |
References
- Friedl, P., Wolf, K., Lammerding, J. Nuclear mechanics during cell migration. Curr Opin Cell Biol. 23, 55-64 (2011).
- Mejat, A., Misteli, T. LINC complexes in health and disease. Nucleus. 1, 40-52 (2010).
- Worman, H. J., Fong, L. G., Muchir, A., Young, S. G. Laminopathies and the long strange trip from basic cell biology to therapy. J Clin Invest. 119, 1825-1836 (2009).
- Caille, N., Tardy, Y., Meister, J. J. Assessment of strain field in endothelial cells subjected to uniaxial deformation of their substrate. Ann Biomed Eng. 26, 409-416 (1998).
- Lammerding, J. Lamins A and C but not lamin B1 regulate nuclear mechanics. J Biol Chem. 281, 25768-25780 (2006).
- Lammerding, J. Abnormal nuclear shape and impaired mechanotransduction in emerin-deficient cells. J Cell Biol. 170, 781-791 (2005).
- Lammerding, J. Lamin A/C deficiency causes defective nuclear mechanics and mechanotransduction. J Clin Invest. 113, 370-378 (2004).
- Verstraeten, V. L., Ji, J. Y., Cummings, K. S., Lee, R. T., Lammerding, J. Increased mechanosensitivity and nuclear stiffness in Hutchinson-Gilford progeria cells: effects of farnesyltransferase inhibitors. Aging Cell. 7, 383-393 (2008).
- Brooks, S. V., Zerba, E., Faulkner, J. A. Injury to muscle fibres after single stretches of passive and maximally stimulated muscles in mice. J Physiol. 488, 459-469 (1995).
- Maniotis, A. J., Chen, C. S., Ingber, D. E. Demonstration of mechanical connections between integrins, cytoskeletal filaments, and nucleoplasm that stabilize nuclear structure. Proc Natl Acad Sci. 94, 849-854 (1997).
