Het creëren van twee-dimensionale Patterned Substraten voor eiwit en Cell opsluiting
Summary
Zelf-geassembleerde monolagen (SAM) gevormd uit lange keten alkaan thiolen op goud bieden goed gedefinieerde substraten voor de vorming van eiwit patronen en cel opsluiting. Microcontact printen van hexadecanethiol met behulp van een polydimethylsiloxaan (PDMS), stempel, gevolgd door opvulling met een glycol-beëindigde alkaan thiol monomeer produceert een patroon waarbij eiwitten en cellen adsorberen alleen aan de gestempelde hexadecanethiol regio.
Abstract
Microcontact printen zorgt voor een snelle, zeer reproduceerbare methode voor het creëren van goed gedefinieerde patroon substraten. 1 Terwijl microcontact afdrukken kan worden gebruikt om rechtstreeks af te drukken van een groot aantal moleculen, zoals eiwitten, DNA 2, 3 en silanen, 4 de vorming van het zelf -geassembleerde monolagen (SAM) van lange keten alkaan thiolen op goud biedt een eenvoudige manier om eiwitten en cellen om specifieke patronen met lijm en bestand zijn tegen de regio's te beperken. Deze opsluiting kan gebruikt worden om celmorfologie controle en is nuttig voor de behandeling van een verscheidenheid aan vragen in eiwit en celbiologie. Hier beschrijven we een algemene methode voor het creëren van goed gedefinieerde eiwitpatronen voor cellulaire studies 5 Dit proces bestaat uit drie stappen:. De productie van een patroon meester met behulp van fotolithografie, de creatie van een PDMS stempel, en microcontact afdrukken van een goud- gecoate substraat. Eenmaal patroon, deze celcultuur substraten in staat zijn van de afbakening van eiwitten en / of cellen (primaire cellen of cellijnen) om het patroon.
Het gebruik van zelf-geassembleerde monolaag chemie zorgt voor nauwkeurige controle over de patroon eiwit / cel lijm regio's en niet-klevende gebieden, dit niet kan worden bereikt met behulp van directe eiwit stempelen. Hexadecanethiol, de lange-keten alkaan thiol gebruikt in de microcontact drukfase, produceert een hydrofoob oppervlak dat gemakkelijk eiwit adsorbeert uit de oplossing. De glycol-beëindigd thiol, gebruikt voor opvullen van de niet-gedrukte regio's van het substraat, ontstaat een monolaag die bestand is tegen eiwit-adsorptie en daarmee de celgroei. 6 Deze thiol monomeren produceren zeer gestructureerde monolagen dat nauwkeurig te definiëren regio's van de substraat dat kan ondersteunen eiwitadsorptie en celgroei. Als gevolg daarvan, deze substraten zijn nuttig voor een breed scala aan toepassingen uit de studie van de intercellulaire gedrag 7 tot de oprichting van micro-elektronica. 8
Terwijl andere soorten monolaag chemie zijn gebruikt voor celkweek studies, waaronder werk van onze groep met behulp van trichloorsilanen om patronen direct op glas substraten te creëren, 9 patroon monolagen gevormd uit alkaan thiolen op goud zijn straight-forward voor te bereiden. Bovendien zijn de monomeren gebruikt worden voor monolaag bereiding zijn commercieel beschikbaar, stabiel en vereisen geen opslag of verwerking onder inerte atmosfeer. Patroon substraten bereid uit alkaan thiolen kan ook worden gerecycled en hergebruikt meerdere malen, onderhouden cel opsluiting. 10
Protocol
Discussion
Een aantal zaken kunnen voordoen in de lithografische productie van de meester wordt gebruikt voor PDMS stempel schepping. Onderbelichting van de resist-gecoate wafer resulteert in een wazige en onduidelijke patronen en overbelichting van de resist-gecoate wafer resulteert in vergrote of ontbrekende functies. In het algemeen, meesters met grote functie maten (> 10 urn) zijn relatief eenvoudig op patroon en te ontwikkelen, terwijl de masters met kleinere functies kunnen een uitgebreide optimalisatie van photopatternin…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We willen graag de hele Maurer groep erkent aan de Washington University waarvan de gezamenlijke kennis heeft gemaakt dit protocol mogelijk te maken. De financiering voor dit werk wordt geleverd door de National Institute of Mental Health (1R01MH085495).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Silicon wafer | Wafer Reclaim Services | 2 inch | |
| Spin coater/hot plate | Brewer Science | Cee 200CB Spin-Bake System | |
| AZ9245 Photoresist | Mays Chemical Company | 105880034-1160 | |
| Direct-write photolithography system | Microtech s.r.l. | LW325 LaserWriter System | |
| Mask Aligner | HTG | 3HR | |
| AZ 400K Developer | Mays Chemical Company | 105880018-1160 | |
| Sylgard 182 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | ||
| 25 mm no. 1 round glass coverslips | VWR | 16004-310 | |
| Plasma Oxidizer | Diener | Femto | |
| Titanium pieces Kamis | Incorporated | 99.95% pure | |
| Gold pellets | Kamis Incorporated | 99.999% pure | |
| Electron-beam evaporator | Kurt J. Lesker | PVD 75 Thin Film Deposition System | with electron-beam accessory |
| Hexadecanethiol | Alfa Aesar | A11362 | |
| 1-mercaptoundec-11-yl)tetra(ethyleneglycol) | Sigma Aldrich | 674508 | |
| Ethanol | Pharmco-aaper | 111000200 | 200 proof, absolute |
| Parafilm | VWR | 52858-000 | |
| DPBS | VWR | 4500-434 | Without calcium and magnesium |
| Mouse Laminin I | VWR | 95036-762 | |
| Human Plasma Fibronectin | Invitrogen | 33016-015 | |
| AlexaFluor® 647 carboxylic acid, succinimidyl ester | Invitrogen | A-20006 | |
| MitoTracker Red 580 | Invitrogen | M22425 | |
| AlexaFluor® 350 carboxylic acid, succinimidyl ester | Invitrogen | A-10168 | |
| Anti-laminin antibody | Fisher Scientific | AB2034MI |
References
- Wilbur, J., Kumar, A., Biebuyck, H., Kim, E., Whitesides, G. Microcontact printing of self-assembled monolayers: Applications in microfabrication. Nanotechnology. 7, 452-457 (1996).
- Chang, J., Brewer, G., Wheeler, B. A modified microstamping technique enhances polylysine transfer and neuronal cell patterning. Biomaterials. 24, 2863-2870 (2003).
- Lange, S., Benes, V., Kern, D., Horber, J., Bernard, A. Microcontact printing of DNA molecules. Analytical Chemistry. , 1641-1647 (2004).
- Xia, Y., Mrksich, M., Kim, E., Whitesides, G. Microcontact printing of octadecylsiloxane on the surface of silicon dioxide and its application in microfabrication. J. Am. Chem. Soc. , 9576-9577 (1995).
- Mrksich, M., Dike, L., Tien, J., Ingber, D., Whitesides, G. Using microcontact printing to pattern the attachment of mammalian cells to self-assembled monolayers of alkanethiolates on transparent films of gold and silver. Experimental Cell Research. , 305-313 (1997).
- Prime, K. L., Whitesides, G. M. Adsorption of proteins onto surfaces containing end-attached oligo(ethylene oxide) – a model system using self-assembled monolayers. J. Am. Chem. Soc. 115, 10714-10721 (1993).
- Raghavan, S., Desai, R., Kwon, Y., Mrksich, M., Chen, C. Micropatterned Dynamically Adhesive Substrates for Cell Migration. Langmuir. , 17733-17738 (2010).
- Rogers, J., Bao, Z., Baldwin, K., Dodabalapur, A., Crone, B., Raju, V. R., Kuck, V., Katz, H., Amundson, K., Ewing, J. Paper-like electronic displays: Large-area rubber-stamped plastic sheets of electronics and microencapsulated electrophoretic inks. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 4835-4840 (2001).
- Yanker, D., Maurer, J. Direct printing of trichlorosilanes on glass for selective protein adsorption and cell growth. Molecular Biosystems. 4, 502-504 (2008).
- Johnson, D., Maurer, J. Recycling and reusing patterned self-assembled monolayers for cell culture. Chemical Communications. , 520-522 (2011).
- Herne, T., Tarlov, M. Characterization of DNA probes immobilized on gold surfaces. J. Am. Chem. Soc. , 8916-8920 (1997).
- Hanson, E., Schwartz, J., Nickel, B., Koch, N., Danisman, M. Bonding self-assembled, compact organophosphonate monolayers to the native oxide surface of silicon. J. Am. Chem. Soc. , 16074-16080 (2003).
- Johannes, M., Cole, D., Clark, R. Atomic force microscope based nanofabrication of master pattern molds for use in soft lithography. Applied Physics Letters. , (2007).
- Bessueille, F., Pla-Roca, M., Mills, C. A., Martinez, E., Samitier, J., Errachid, A. Submerged microcontact printing (SμCP): An unconventional printing technique of thiols using high aspect ratio, elastomeric stamps. Langmuir. , 12060-12063 (2005).
- Xia, Y., Whitesides, G. Extending microcontact printing as a microlithographic technique. Langmuir. , 2059-2067 (1997).
- Biasco, A., Pisignano, D., Krebs, B., Pompa, P. P., Persano, L., Cingolani, R., Rinaldi, R. Conformation of microcontact-printed proteins by atomic force miroscopy molecular sizing. Langmuir. , 5154-5158 (2005).
- Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. Microcontact printing of proteins for cell biology. J Vis Exp. (22), e1065-e1065 (2008).
- Piner, R., Zhu, J., Xu, F., Hong, S., Mirkin, C. “Dip-pen” nanolithography. Science. 283, 661-663 (1999).
- Ryan, D., Parviz, B. A., Linder, V., Semetey, V., Sia, S. K., Su, J., Mrksich, M., Whitesides, G. M. Patterning multiple aligned self-assembled monolayers using light. Langmuir. , 9080-9088 (2004).
