Summary

Erstellen Zweidimensionale Patterned Substrate für Protein-und Zell-Confinement

Published: September 06, 2011
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Summary

Selbstorganisierte Monoschichten (SAMs) aus langkettigen Alkan Thiolen auf Gold gebildet ist gut definierten Substraten für die Bildung von Protein-Muster-und Zell-Entbindung. Mikrokontaktdruck von Hexadecanthiol mit einem Polydimethylsiloxan (PDMS)-Stempel durch Verfüllung mit folgten einem Glykol-terminierte Alkanthiol Monomer erzeugt ein Muster, bei dem Protein und Zellen adsorbieren nur den Stempel Hexadecanthiol Region.

Abstract

Mikrokontaktdruck bietet eine schnelle, reproduzierbare Methode für die Schaffung von gut definierten Muster Substraten. 1 Während Mikrokontaktdrucken kann zur direkten Drucken einer großen Anzahl von Molekülen, einschließlich Proteinen, 2 DNA, 3 und Silane, 4 die Bildung von Selbst zu sein Monoschichten (SAMs) aus langkettigen Alkan Thiolen auf Gold bietet eine einfache Möglichkeit, um Proteine ​​und Zellen in bestimmten Mustern mit Klebstoff und beständig Regionen beschränken. Diese Beschränkung kann zur Zellmorphologie zu kontrollieren und ist nützlich für die Prüfung einer Vielzahl von Fragen in Protein-und Zellbiologie. Hier beschreiben wir ein allgemeines Verfahren für die Schaffung von gut definierten Protein-Muster für die zelluläre Studien 5 Dieser Prozess umfasst drei Schritte:. Die Herstellung eines gemusterten Master mittels Photolithographie, die Schaffung eines PDMS-Stempel und Mikrokontaktdrucken einer Gold- beschichteten Substrat. Sobald gemustert, sind diese Zellkultursubstraten der Lage beschränken Proteine ​​und / oder Zellen (primäre Zellen oder Zelllinien), um das Muster.

Der Einsatz von selbstorganisierten Monoschicht Chemie ermöglicht eine präzise Kontrolle über die strukturierte Protein / zelladhäsive Regionen und nicht klebend Regionen, dies kann nicht erreicht werden durch direkte Protein Stanzen werden. Hexadecanthiol, die lange Kette Alkanthiol in der Mikrokontaktdrucken Schritt verwendet, erzeugt eine hydrophobe Oberfläche, die leicht adsorbiert Protein aus der Lösung. Der Glykol-terminierten Thiol, zur Verfüllung der nicht bedruckten Bereichen des Substrats verwendet, schafft eine Monoschicht, die resistent gegen Proteinadsorption und damit das Zellwachstum ist. 6 Diese Thiol Monomere produzieren stark strukturierten Monolagen, die genau definieren Bereiche des Substrats, die unterstützen können Proteinadsorption und Zellwachstum. Als Ergebnis werden diese Substrate für eine Vielzahl von Anwendungen nützlich aus dem Studium der interzellulären Verhalten 7 zur Erstellung der Mikroelektronik. 8

Obgleich auch andere Arten von Mono-Chemie für Zellkultur-Studien, darunter Arbeiten aus unserer Gruppe mit Trichlorsilanen um Muster direkt auf Glassubstraten erstellen verwendet wurden, sind 9 gemusterten Monoschichten aus Alkan Thiolen auf Gold gebildet geradlinig, sich vorzubereiten. Darüber hinaus sind die Monomere für Monoschicht Präparation im Handel erhältlich, stabil und erfordern keine Lagerung oder Handhabung unter einer inerten Atmosphäre. Gemusterte Substrate aus Alkanthiole vorbereitet können auch recycelt und mehrfach wiederverwendet werden, die Aufrechterhaltung Zelle Gefangenschaft. 10

Protocol

1. Vorbereitung der Patterned Master (Abbildung 1) Zentrum der Silizium-Wafer auf dem Spin-Coater und spülen Sie die Wafer mit Aceton in der ersten Stufe des zweistufigen Spin-Programm in Tabelle 1. Das Aceton wird im zweiten Schritt des Spin-Programm hinterlässt eine saubere, trockene Wafer verdampfen. Wenden Sie ca. 1 mL AZ9245 Fotolack / in (im Durchmesser) auf den Wafer-und Spin-Mantel mit den in Tabelle 1 beschrieben. Soft-backen der Fotolack beschichtete Wafer bei 110 ° C für 2 m…

Discussion

Eine Reihe von Fragen kann in die lithographische Herstellung des Masters für PDMS-Stempel-Erstellung verwendet entstehen. Unterbelichtung der Resist beschichteten Wafer Ergebnisse in verschwommen und undeutlich Muster und Überbelichtung der Resist beschichteten Wafer Ergebnisse in einer vergrößerten oder fehlende Funktionen. Im Allgemeinen sind die Meister mit großen Strukturgrößen (> 10 um) relativ leicht zu Muster und entwickeln, während Meister mit kleineren bietet umfangreiche Optimierung der Photostrukt…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir möchten die gesamte Maurer Gruppe an der Washington University, deren kollektives Wissen hat dieses Protokoll möglich anzuerkennen. Die Finanzierung dieser Arbeit wird durch das National Institute of Mental Health (1R01MH085495) zur Verfügung gestellt.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments (optional)
Silicon wafer Wafer Reclaim Services   2 inch
Spin coater/hot plate Brewer Science Cee 200CB Spin-Bake System  
AZ9245 Photoresist Mays Chemical Company 105880034-1160  
Direct-write photolithography system Microtech s.r.l. LW325 LaserWriter System  
Mask Aligner HTG 3HR  
AZ 400K Developer Mays Chemical Company 105880018-1160  
Sylgard 182 Silicone Elastomer Kit Dow Corning    
25 mm no. 1 round glass coverslips VWR 16004-310  
Plasma Oxidizer Diener Femto  
Titanium pieces Kamis Incorporated   99.95% pure
Gold pellets Kamis Incorporated   99.999% pure
Electron-beam evaporator Kurt J. Lesker PVD 75 Thin Film Deposition System with electron-beam accessory
Hexadecanethiol Alfa Aesar A11362  
1-mercaptoundec-11-yl)tetra(ethyleneglycol) Sigma Aldrich 674508  
Ethanol Pharmco-aaper 111000200 200 proof, absolute
Parafilm VWR 52858-000  
DPBS VWR 4500-434 Without calcium and magnesium
Mouse Laminin I VWR 95036-762  
Human Plasma Fibronectin Invitrogen 33016-015  
AlexaFluor® 647 carboxylic acid, succinimidyl ester Invitrogen A-20006  
MitoTracker Red 580 Invitrogen M22425  
AlexaFluor® 350 carboxylic acid, succinimidyl ester Invitrogen A-10168  
Anti-laminin antibody Fisher Scientific AB2034MI  

References

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Johnson, D. M., LaFranzo, N. A., Maurer, J. A. Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement. J. Vis. Exp. (55), e3164, doi:10.3791/3164 (2011).

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