La creazione di substrati Patterned bidimensionali per confinamento di proteine e cellule
Summary
Monostrati auto-assemblati (SAM) formato da tioli alcani a catena lunga su oro fornire ben definito substrati per la formazione di pattern proteico delle cellule e di confino. Stampa microcontact di hexadecanethiol utilizzando un (PDMS) polidimetilsilossano timbro seguita da riempimento con un glicole-terminated alcano tiolo monomero produce un modello in cui proteine e cellule di assorbire solo alla regione timbrato hexadecanethiol.
Abstract
Stampa microcontact fornisce un metodo rapido e altamente riproducibile per la creazione di ben definite substrati fantasia. 1 Durante la stampa microcontact può essere impiegato per stampare direttamente un gran numero di molecole, tra cui le proteine, DNA 2, 3 e silani, 4 la formazione del sé monostrati-assemblati (SAM) dal tioli alcani a catena lunga in oro fornisce un modo semplice per limitare le proteine e le cellule di specifici modelli contenenti regioni adesivo e resistente. Questo confinamento può essere utilizzato per controllare la morfologia delle cellule ed è utile per l'esame di una serie di domande di proteine e di biologia cellulare. Qui, descriviamo un metodo generale per la creazione di ben definiti i modelli per lo studio delle proteine cellulari 5 Questo processo prevede tre fasi:. La produzione di un maestro di fantasia utilizzando fotolitografia, stampa la creazione di un francobollo PDMS, e microcontatto di un oro- substrato rivestito. Una volta modellato, questi substrati di coltura cellulare sono in grado di confinare le proteine e / o cellule (cellule primarie o linee cellulari) per il modello.
L'uso di auto-assemblati chimica monostrato consente un controllo preciso sulla fantasia di proteine / cella regioni adesive e non adesive regioni; questo non può essere realizzato utilizzando stampaggio diretto delle proteine. Hexadecanethiol, la lunga catena tiolo alcano utilizzato nel passaggio stampa microcontact, produce una superficie idrofoba che assorbe facilmente le proteine dalla soluzione. Il glicol-terminated tiolo, utilizzato per il riempimento non stampate regioni del substrato, crea un monostrato che è resistente a proteine e quindi la crescita delle cellule. 6 Questi monomeri tiolo produrre monostrati strutturate che definire con precisione le regioni del substrato in grado di supportare proteine e la crescita cellulare. Come risultato, questi supporti sono utili per una vasta gamma di applicazioni da studio del comportamento intercellulare 7 alla creazione della microelettronica 8.
Mentre altri tipi di chimica monostrato sono stati utilizzati per studi su colture cellulari, compreso il lavoro del nostro gruppo utilizzando trichlorosilanes per creare modelli direttamente su substrati di vetro, 9 monostrati fantasia formato da alcano tioli su oro sono straight-forward per la preparazione. Inoltre, i monomeri utilizzati per la preparazione monostrato sono disponibili in commercio, stabile, e non richiedono la conservazione o la manipolazione in atmosfera inerte. Substrati preparati con fantasia tioli alcano possono essere riciclati e riutilizzati più volte, mantenendo la reclusione cellula 10.
Protocol
Discussion
Un certo numero di problemi possono insorgere nella produzione litografica del master utilizzato per la creazione timbro PDMS. Sottoesposizione di resistere rivestite risultati wafer nei modelli confusa e indistinta e sovraesposizione del resistere rivestite risultati wafer di caratteristiche ingrandita o mancanti. In generale, i maestri con dimensioni caratteristiche di grandi dimensioni (> 10 micron) sono relativamente facili da sviluppare e modello, mentre i maestri con le più piccole caratteristiche possono rich…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare tutto il gruppo Maurer presso la Washington University, il cui collettivo ha fatto la conoscenza di questo protocollo possibile. Il finanziamento per questo lavoro è fornito dal National Institute of Mental Health (1R01MH085495).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Silicon wafer | Wafer Reclaim Services | 2 inch | |
| Spin coater/hot plate | Brewer Science | Cee 200CB Spin-Bake System | |
| AZ9245 Photoresist | Mays Chemical Company | 105880034-1160 | |
| Direct-write photolithography system | Microtech s.r.l. | LW325 LaserWriter System | |
| Mask Aligner | HTG | 3HR | |
| AZ 400K Developer | Mays Chemical Company | 105880018-1160 | |
| Sylgard 182 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | ||
| 25 mm no. 1 round glass coverslips | VWR | 16004-310 | |
| Plasma Oxidizer | Diener | Femto | |
| Titanium pieces Kamis | Incorporated | 99.95% pure | |
| Gold pellets | Kamis Incorporated | 99.999% pure | |
| Electron-beam evaporator | Kurt J. Lesker | PVD 75 Thin Film Deposition System | with electron-beam accessory |
| Hexadecanethiol | Alfa Aesar | A11362 | |
| 1-mercaptoundec-11-yl)tetra(ethyleneglycol) | Sigma Aldrich | 674508 | |
| Ethanol | Pharmco-aaper | 111000200 | 200 proof, absolute |
| Parafilm | VWR | 52858-000 | |
| DPBS | VWR | 4500-434 | Without calcium and magnesium |
| Mouse Laminin I | VWR | 95036-762 | |
| Human Plasma Fibronectin | Invitrogen | 33016-015 | |
| AlexaFluor® 647 carboxylic acid, succinimidyl ester | Invitrogen | A-20006 | |
| MitoTracker Red 580 | Invitrogen | M22425 | |
| AlexaFluor® 350 carboxylic acid, succinimidyl ester | Invitrogen | A-10168 | |
| Anti-laminin antibody | Fisher Scientific | AB2034MI |
References
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