הלב Dissection ב הזחל, דג הזברה לנוער ו למבוגרים, Danio rerio</em
Summary
שיטה ברורה, תקנית לנתיחה ובידוד של הלב דג הזברה בשלבים התפתחותיים מרובים מתוארים. טכניקות ביאור וכימות הם דנו גם.
Abstract
דג הזברה הפכו אורגניזם מודל מועיל ומעשי ללימוד התפתחות הלב העוברי (ראה הסקירות האחרונות 1-6), לעומת זאת, העבודה בוחנת שלאחר עובריים באמצעות פיתוח מבוגר לב הוגבל 7-10. בחינת המורפולוגיה שינוי של הלב התבגרות והזדקנות מוגבלים על ידי חוסר של טכניקות עבור הבימוי ובידוד לבבות צעירים ומבוגרים. על מנת לנתח את התפתחות הלב על תוחלת החיים של הדגים, אנו לנתח לבבות דג הזברה בשלבים רבים לצלם אותם לניתוח נוסף 11. המאפיינים המורפולוגיים של הלב יכול בקלות לכימות ולבבות בודדים ניתן לנתח עוד יותר על ידי שורה של שיטות סטנדרטיות. דג הזברה לצמוח בקצב משתנה התבגרות בקורלציה טובה עם גודל הדג לגיל, וכך, לאחר קיבוע, אנחנו מצלמים ולמדוד אורך דגים כמדד של התבגרות הדג. פרוטוקול זה מסביר two ברורים, טכניקות גודל לנתיחה תלוי על דג הזברה, החל אורך הזחלים 3.5mm סטנדרטית (SL) עם לבבות של אורך החדר 100μm (VL), על מבוגרים, עם SL של 30mm ו VL 1mm או גדולים יותר. דגים הזחל למבוגרים יש גוף שונה לגמרי ומורפולוגיה איברים. הזחלים הם לא רק קטן יותר באופן משמעותי, יש להם פחות פיגמנט כל איבר הוא ויזואלית קשה מאוד לזהות. מסיבה זו, אנו משתמשים בטכניקות שונות לנתיחה.
השתמשנו מראש לנתיחה קיבעון הליכים, כפי שגילינו כי לבבות גזור ישירות לאחר euthanization יש מורפולוגיה משתנה יותר, עם בלון רופף מאוד כמו אטריה בהשוואה לבבות להסיר קיבוע הבאה. הדגים קבוע לפני לנתיחה, לשמור במורפולוגיה vivo ואת המיקום קאמרית (מידע לא מוצג). בנוסף, למטרות הדגמה, אנו מנצלים את הלב (שריר הלב) ספציפי GFP מהונדס Tg (myl7: GFP) twu34 (12), אשר מאפשר לנו לדמיין את הלב כולו והוא שימושי במיוחד בשלבים הראשונים בהתפתחות כאשר הלב מורפולוגיה היא ברורה פחות הרקמות הסובבות. Dissection הלב עושה ניתוח נוסף של התא וביולוגיה מולקולרית הבסיסית לפיתוח לב התבגרות משתמש הכלאה באתרו, אימונוהיסטוכימיה, מיצוי RNA או שיטות אנליטיות אחרות קל יותר דג הזברה שלאחר עובריים. פרוטוקול זה יספק טכניקה ערך לחקר הזדקנות התבגרות התפתחות הלב.
Protocol
Discussion
אלה שיטות לניתוח הלב דג הזברה של דגים שלאחר עובריים מאפשר הסרה מלאה של הלב ניזוק. אמנם שיטה זו היא פשוטה, ומספק מדריכים עבור חתכים חיצוניים שימנעו פגיעה בלב, יד יציבה חיונית דגים קטנים יותר.
צעד מרכזי במהלך דיסקציה היא לזהות את קרו…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
תודה מארי Birne, ארטי Tsiola, Jaymie אסטבס Arelys אוריבה. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי CUNY Research Foundation ו – הווארד יוז רפואי מכון גרנט תוכנית קיץ לסטודנטים לתואר ראשון (השלוחה) ו-NIH RO3 41702-00-01. המחקר נתמך גם על ידי בקווינס קולג' וחלק הניסויים נעשו על ציוד ממתקן Core for Imaging, ביולוגיה תאית ומולקולרית בקווינס קולג'.
Materials
| Material | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Paraformaldehyde | EMD | PX0055 | .04g/mL in PBS |
| Forceps #55 | FST | 11295-51 | |
| Micro-scissors | FST | 15005-08 | |
| Pin holder | FST | 26016-12 | |
| Micro-needles | FST | 10130-10 | |
| Nutrient Agar | BBL | 11472 | 23g/L in distilled H2O |
| Petri dishes | BD Falcon | 351029 | |
| PCR 8-tube strips | USA Scientific | 1402-2500 | |
| Digital Caliper | Fisher Scientific | 14-648-17 |
References
- Ahmad, N., Long, S., Rebagliati, M. A southpaw joins the roster: the role of the zebrafish nodal-related gene southpaw in cardiac LR asymmetry. Trends Cardiovasc Med. 14, 43-49 (2004).
- Armstrong, E. J., Bischoff, J. Heart valve development: endothelial cell signaling and differentiation. Circ Res. 95, 459-470 (2004).
- Bakkers, J., Verhoeven, M. C., Abdelilah-Seyfried, S. Shaping the zebrafish heart: from left-right axis specification to epithelial tissue morphogenesis. Dev Biol. 330, 213-220 (2009).
- Glickman, N. S., Yelon, D. Cardiac development in zebrafish: coordination of form and function. Semin Cell Dev Biol. 13, 507-513 (2002).
- Heicklen-Klein, A., McReynolds, L. J., Evans, T. Using the zebrafish model to study GATA transcription factors. Semin Cell Dev Biol. 16, 95-106 (2005).
- Schoenebeck, J. J., Yelon, D. Illuminating cardiac development: Advances in imaging add new dimensions to the utility of zebrafish genetics. Semin Cell Dev Biol. 18, 27-35 (2007).
- Beis, D. Genetic and cellular analyses of zebrafish atrioventricular cushion and valve development. Development. 132, 4193-4204 (2005).
- Lepilina, A. A dynamic epicardial injury response supports progenitor cell activity during zebrafish heart regeneration. Cell. 127, 607-619 (2006).
- Wills, A. A., Holdway, J. E., Major, R. J., Poss, K. D. Regulated addition of new myocardial and epicardial cells fosters homeostatic cardiac growth and maintenance in adult zebrafish. Development. 135, 183-192 (2008).
- Parichy, D. M., Elizondo, M. R., Mills, M. G., Gordon, T. N., Engeszer, R. E. Normal table of postembryonic zebrafish development: staging by externally visible anatomy of the living fish. Dev Dyn. 238, 2975-3015 (2009).
- Huang, C. J., Tu, C. T., Hsiao, C. D., Hsieh, F. J., Tsai, H. J. Germ-line transmission of a myocardium-specific GFP transgene reveals critical regulatory elements in the cardiac myosin light chain 2 promoter of zebrafish. Dev Dyn. 228, 30-40 (2003).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book, A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (1995).
