Birden fazla gelişim evreleri zebrafish kalp diseksiyonu ve izolasyon için açık, standart bir yöntem açıklanmıştır. Annotation ve miktar teknikler de tartışılmaktadır.
Zebra balığı çalışma (son değerlendirmeleri görmek 1-6) embriyonik kalp gelişimi için yararlı ve pratik bir model organizma haline gelmiştir, ancak 7-10 sınırlı kalmıştır yetişkin kalp geliştirilmesi yoluyla post-embriyonik inceleyerek işe . Olgunlaşan ve yaşlanma kalp değişen morfoloji incelenmesi, genç ve yetişkin kalpleri evreleme ve izole etmek için uygun teknikler eksikliği ile sınırlıdır. Balığın ömrü boyunca kalp gelişimini analiz etmek için, çeşitli aşamalarda zebrafish kalpleri incelemek ve onları daha fazla analiz için 11 fotoğraf. Kalbin morfolojik özellikleri kolayca sayısal ve bireysel kalpleri daha bir dizi standart yöntemler ile analiz edilebilir. Zebra balığı değişken oranlı büyüme ve olgunlaşma, dolayısıyla balık olgunlaşma bir göstergesi olarak post-fiksasyon, fotoğraf ve ölçü balık uzunluğu, yaş daha balık boyutu ile daha fazla ilişkili. Bu protokol ile 30mm ve VL 1mm SL veya daha büyük, yetişkin 100μm ventrikül uzunluğu (VL) kalplerini larva 3.5mm standart uzunluğu (SL) arasında değişen iki ayrı zebrafish için, boyut bağımlı diseksiyon teknikleri, açıklar. Larva ve ergin balıklar oldukça farklı bir vücut ve organ morfolojisi vardır. Larva sadece daha küçük değil, daha az pigment ve her organ görsel olarak tespit etmek çok zordur. Bu nedenle, biz farklı diseksiyon teknikleri kullanır.
Euthanization sonra doğrudan disseke kalpleri kulakçıklar gibi çok gevşek ve balon ile aşağıdaki fiksasyon kaldırıldı kalpleri ile karşılaştırıldığında, daha değişken bir morfoloji olduğunu keşfettiği gibi, pre-diseksiyonu fiksasyon yöntemleri kullanılır. Balık, in vivo morfolojisi ve oda pozisyonlar (veriler gösterilmemiştir) korumak diseksiyon önce sabit . Buna ek olarak, gösteri amaçlı, kalp (miyokard) belirli GFP transgenik Tg (myl7 GFP) yararlanmak için bize tüm kalp görüntülemenizi sağlar ve geliştirme erken aşamalarında özellikle yararlıdır twu34 (12), kalp morfolojisi çevre dokulara daha az belirgindir. Kalp Diseksiyon in situ hibridizasyon, immunohistokimya, RNA ekstraksiyonu veya diğer post-embriyonik zebrafish kolay analitik yöntemler kullanarak kalp gelişme ve olgunlaşma altında yatan hücre ve moleküler biyoloji daha fazla analiz yapar. Bu protokol, kalp gelişim olgunlaşma ve yaşlanma çalışma için değerli bir teknik sağlayacaktır.
Post-embriyonik balık zebrafish kalp diseksiyonu için bu yöntemleri hasarsız bir kalp tümüyle kaldırılmasını sağlar. Bu teknikte basittir ve dış kesimler için kalbin zarar görmesini önlemek kılavuzları sağlarken, sürekli bir yandan küçük balıklar için önemlidir.
Diseksiyonu sırasında bir önemli adım kalp bu kese içinde doğrudan gümüş perikard belirlemektir. Perikard görselleştirme vücut boşluğunda bulma ve sonuçta kalp formunu kaldırarak önemli bir …
The authors have nothing to disclose.
Marie Birne, Areti Tsiola, Jaymie Estevez ve Arelys Uribe teşekkür ederiz. Bu çalışma CUNY Araştırma Vakfı ve Howard Hughes Tıp Enstitüsü Hibe Lisans Öğrencileri için Yaz Programı (SPUR) ve NIH RO3'ü 41702-00-01 kısmen desteklenmiştir. Araştırma ayrıca, Queens College ve bazı deneyler Görüntüleme, Queens College'da Hücresel ve Moleküler Biyoloji Core Tesisi ekipman yapıldı tarafından desteklenmiştir.
Material | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
---|---|---|---|
Paraformaldehyde | EMD | PX0055 | .04g/mL in PBS |
Forceps #55 | FST | 11295-51 | |
Micro-scissors | FST | 15005-08 | |
Pin holder | FST | 26016-12 | |
Micro-needles | FST | 10130-10 | |
Nutrient Agar | BBL | 11472 | 23g/L in distilled H2O |
Petri dishes | BD Falcon | 351029 | |
PCR 8-tube strips | USA Scientific | 1402-2500 | |
Digital Caliper | Fisher Scientific | 14-648-17 |