En tydlig och standardiserad metod för dissekering och isolering av zebrafisk hjärtat på flera utvecklingsstadier beskrivs. Annotering och kvantifiering tekniker diskuteras också.
Zebrafisk har blivit en positiv och praktisk modell organism för studier av embryonala hjärtat utveckling (se guide 1-6), men arbetet undersöka post-embryonala genom vuxen hjärt utveckling har varit begränsade 7-10. Undersöka ändra morfologi mogna och åldrande hjärta begränsas av bristen på tekniker för mellanstationer och isolera unga och vuxna hjärtan. För att analysera hjärtats utveckling under fiskens livscykel, dissekera vi zebrafisk hjärtan på flera stadier och fotografera dem för vidare analys 11. Den morfologiska funktioner i hjärtat kan lätt kvantifieras och enskilda hjärtan kan analyseras ytterligare genom en mängd standardmetoder. Zebrafisk växa till rörlig ränta och mognad korrelerar bättre med fisk storlek än ålder, alltså efter fixering, vi fotograferar och mäta fisk längd som en mätare av fisk mognad. Detta protokoll förklarar två olika, storlek beroende dissektion tekniker för zebrafisk, allt från larver 3,5 mm standard längd (SL) med ett hjärta av 100μm ventrikeln längd (VL), för vuxna, med SL i 30mm och VL 1 mm eller större. Larver och vuxen fisk har helt olika kropp och orgel morfologi. Larver är inte bara betydligt mindre, de har mindre pigment och varje organ är visuellt mycket svårt att identifiera. Av denna anledning använder vi olika dissektion tekniker.
Vi använde före dissektion förfaranden fixering, eftersom vi upptäckt att hjärtan dissekeras direkt efter euthanization har en mer varierande morfologi, med mycket lös och ballong som förmak jämfört med hjärtan bort efter fixering. Fisken fasta före dissektion, behålla in vivo morfologi och kammare ställning (data visas inte). Dessutom, för demonstration tar vi nytta av hjärtat (hjärtinfarkt) särskilda GFP transgena Tg (myl7: GFP) twu34 (12), som tillåter oss att visualisera hela hjärtat och är särskilt användbart i tidiga stadier i utvecklingen när hjärt- morfologi är mindre skiljer sig från omgivande vävnader. Dissektion av hjärtat ger ytterligare analys av cell-och molekylärbiologi underliggande hjärt utveckling och mognad med in situ hybridisering, immunohistokemi, RNA-extraktion eller andra analysmetoder lättare i post-embryonal zebrafisk. Detta protokoll kommer att ge en värdefull teknik för att studera hjärtats utveckling mognad och åldrande.
Dessa metoder för dissekering av zebrafisk hjärtat av post-embryonala fisk möjliggör fullständig borttagning av ett oskadat hjärta. Även om denna teknik är enkel och ger riktlinjer för extern nedskärningar som förhindrar skador på hjärtat, är en stadig hand viktigt för mindre fiskar.
Ett viktigt steg under dissektionen är att identifiera de silverfärgade hjärtsäcken som hjärtat är direkt inom detta SAC. Visualisera hjärtsäck är en viktig markör för att hitta och slu…
The authors have nothing to disclose.
Tack vare Marie Birne, Areti Tsiola, Jaymie Estevez och Arelys Uribe. Detta arbete stöddes delvis av CUNY Research Foundation och Howard Hughes Medical Institute Grant sommarskola för studenter (SPUR) och NIH RO3 41702-00-01. Forskning stöddes också av Queens College och några av experimenten gjordes på utrustning från Core Facility for Imaging, Cell-och molekylärbiologi vid Queens College.
Material | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
---|---|---|---|
Paraformaldehyde | EMD | PX0055 | .04g/mL in PBS |
Forceps #55 | FST | 11295-51 | |
Micro-scissors | FST | 15005-08 | |
Pin holder | FST | 26016-12 | |
Micro-needles | FST | 10130-10 | |
Nutrient Agar | BBL | 11472 | 23g/L in distilled H2O |
Petri dishes | BD Falcon | 351029 | |
PCR 8-tube strips | USA Scientific | 1402-2500 | |
Digital Caliper | Fisher Scientific | 14-648-17 |