La disección del corazón en las larvas, juveniles y adultos de pez cebra, Danio rerio</em
Summary
Un método claro y estandarizado para la disección y el aislamiento del corazón del pez cebra en varias etapas de desarrollo se describen. Técnicas de anotación y cuantificación también se discuten.
Abstract
Pez cebra se han convertido en un organismo modelo beneficioso y práctico para el estudio del desarrollo embrionario del corazón (ver comentarios de los últimos 1-6), sin embargo, el trabajo de examen de post-embrionario a través del desarrollo adulto cardiaca se ha limitado 7.10. Examinar el cambio de morfología del corazón de maduración y el envejecimiento se ven limitadas por la falta de técnicas disponibles para la puesta en escena y el aislamiento de los corazones juveniles y adultos. Con el fin de analizar el desarrollo del corazón durante la vida útil del pescado, que diseccionan el corazón del pez cebra en varias etapas y una fotografía para su posterior análisis 11. Las características morfológicas del corazón puede ser cuantificado y corazones individuales pueden ser analizados por una serie de métodos estándar. Pez cebra crecen a tasas variables y la maduración se correlaciona mejor con el tamaño de los peces de la edad, por lo tanto, posterior a la fijación, longitud del pez fotografía y medida como un indicador de la maduración de los peces. Este protocolo se explican dos técnicas distintas, el tamaño de la disección dependientes de pez cebra, que van desde 3,5 mm de longitud estándar larvas (SL) con el corazón de la longitud del ventrículo 100μm (VL), a los adultos, con el SL de 30 mm y 1 mm de VL o más grande. Las larvas de peces y adultos tienen el cuerpo muy diferente y la morfología de órganos. Las larvas no sólo son significativamente más pequeños, tienen menos pigmento y cada órgano es visualmente muy difíciles de identificar. Por esta razón, utilizamos distintas técnicas de disección.
Se utilizó antes de la disección de los procedimientos de fijación, como hemos descubierto que el corazón disecado directamente después de la eutanasia tienen una morfología más variable, con el balón muy flojo y como aurículas en comparación con el corazón eliminado después de la fijación. Los peces fijo antes de la disección, mantener vivo en la morfología y la posición de la cámara (datos no mostrados). Además, para fines de demostración, nos aprovechamos del corazón (miocardio) específicos GFP transgénicos Tg (myl7: GFP) twu34 (12), que nos permite visualizar todo el corazón y es particularmente útil en las primeras etapas de desarrollo, cuando el corazón morfología es menos clara de los tejidos circundantes. La disección del corazón hace un mayor análisis de la biología celular y molecular que subyacen al desarrollo del corazón y la maduración utilizando hibridación in situ, inmunohistoquímica, la extracción de RNA o otros métodos analíticos más fácil en el post-embrionario del pez cebra. Este protocolo proporciona una técnica valiosa para el estudio de la maduración de desarrollo cardíaco y el envejecimiento.
Protocol
Discussion
Estos métodos para la disección del corazón del pez cebra de post-embrionario de peces permite la extirpación completa de un corazón en buen estado. Si bien esta técnica es sencilla y ofrece guías para los cortes externos que evitar que se dañe el corazón, una mano firme es esencial para los peces más pequeños.
Un paso clave en la disección es identificar el pericardio plateado como el corazón está directamente dentro de este saco. Visualizar el pericardio proporciona un marcad…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gracias a Marie Birne, Tsiola Areti, Estévez Jaymie y Arelys Uribe. Este trabajo fue apoyado en parte por la Fundación de Investigación de CUNY y Howard Hughes Medical Institute Programa de Verano de becas para estudiantes de pregrado (SPUR) y NIH SR3 41702-00-01. La investigación también fue apoyada por el Queens College y algunos de los experimentos se realizaron en el equipo del Fondo para el núcleo de la Imagen, Biología Celular y Molecular de la Universidad de Queens.
Materials
| Material | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Paraformaldehyde | EMD | PX0055 | .04g/mL in PBS |
| Forceps #55 | FST | 11295-51 | |
| Micro-scissors | FST | 15005-08 | |
| Pin holder | FST | 26016-12 | |
| Micro-needles | FST | 10130-10 | |
| Nutrient Agar | BBL | 11472 | 23g/L in distilled H2O |
| Petri dishes | BD Falcon | 351029 | |
| PCR 8-tube strips | USA Scientific | 1402-2500 | |
| Digital Caliper | Fisher Scientific | 14-648-17 |
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