Ändern der Ausrichtung und Orientierung des elektrischen Feldes während elektrische Impulse Anwendung Verbessert Plasmid Gene Transfer In-vitro-</em
Summary
Gene Transfektion durch Elektroporation etwa zwei Mal wird verbessert, wenn Ausrichtung des elektrischen Feldes während der Puls-Anwendung geändert wird, während die Lebensfähigkeit der Zellen nicht beeinträchtigt wird. Der Anstieg in Gentransfektion wird durch die Erhöhung der Membranfläche, die kompetent gemacht für die DNA-Eintritt in die Zelle verursacht wird.
Abstract
Gene Elektrotransfer ist eine physikalische Methode verwendet, um Gene in die Zellen liefern durch die Anwendung von kurzen und intensiven elektrischen Impulsen, die Destabilisierung der Zellmembran führen, wodurch es durchlässig für kleine Moleküle und ermöglicht die Übertragung von großen Molekülen wie DNA. Es stellt eine Alternative zu viralen Vektoren, wegen seiner Sicherheit, Wirksamkeit und einfache Anwendung. Für Gen Elektrotransfer verschiedenen elektrischen Impuls Protokolle verwendet werden, um eine maximale Gentransfektion zu erreichen, einer von ihnen verändert sich das elektrische Feld Richtung und Orientierung während der Impulsabgabe. Ändern elektrische Feld Richtung und Orientierung Erhöhung der Membranfläche zuständig für DNA Eintritt in die Zelle. In diesem Video zeigen wir den Unterschied in der Gen-Elektrotransfer Wirksamkeit, wenn alle Impulse in die gleiche Richtung geliefert werden und Impulse werden von wechselnden alternativ das elektrische Feld Richtung und Orientierung geliefert. Zu diesem Zweck Spitze mit integrierten Elektroden und Hochspannungs-Prototyp-Generator, der Wechsel des elektrischen Feldes in verschiedene Richtungen während der elektrische Impuls-Anwendung ermöglicht, verwendet wurden. Gene Elektrotransfer Wirksamkeit bestimmt 24 Stunden nach dem Puls-Anwendung als die Anzahl der Zellen, die grün fluoreszierendes Protein mit der Anzahl aller Zellen aufgeteilt. Die Ergebnisse zeigen, dass Gen-Transfektion erhöht wird, wenn das elektrische Feld Orientierung während der elektrische Impuls Lieferung geändert wird.
Protocol
Discussion
Gene Elektrotransfer ist eine vielseitige Technik, Biotechnologie Transfer von DNA in Zellen ermöglicht durch Anwendung kurz-, Hochspannungs-elektrische Impulse 3 und stellt eine sichere Alternative zu viralen Vektoren aufgrund ihrer Sicherheit, Wirksamkeit und einfache Anwendung. Obwohl heute Gen Elektrotransfer weit verbreitet ist, um alle Arten von Zellen und erste klinische Phase I Studie mit dieser Methode transfizieren wurde 4 berichtet, sind die zugrunde liegenden Mechanismen noch nicht vol…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der slowenischen Research Agency (Projekt J2-9770, infrastrukturelle Zentrum IP-0510 und das Programm P2-0249) unterstützt. Dieses Video stellt ergänzendes Material für die "Elektroporation basierenden Technologien und Behandlungsmethoden" wissenschaftlichen Workshop und Aufbaustudium, von der Fakultät für Elektrotechnik an der University of Ljubljana, Slowenien organisiert. Autoren danken auch Duša Hodzic für die freundliche Bereitstellung Plasmid-DNA.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| HAM-F12 | PAA | E15-016 | culture medium |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| fetal bovine serum | PAA | A15-151 | |
| gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | antibiotic |
| crystacilin | Pliva | 625110 | antibiotic |
| pEGFP-N1 | Clontech Laboratories | 6085-1 | plasmid DNA |
| HiSpeed Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12662 | |
| Na2HPO4 | Merck | F640786 933 | |
| NaH2PO4 | TKI Hrastnik | 0795 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M-8266 | |
| sucrose | Sigma-Aldrich | 16104 | |
| trypsin/EDTA solution | Sigma-Aldrich | T4174 | |
| pipette tip | Custom made | ||
| electric pulse generator | Custom made | ||
| 6 well plate | TPP | 92406 | |
| 15 ml centrifuge tube | TPP | 91015 | |
| 75 cm2 culture flask | TPP | 90076 |
References
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