Изменение направления и ориентации электрического поля во время применения электрических импульсов Улучшает плазмиды перенос генов В пробирке</em
Summary
Гена трансфекции электропорацией улучшается примерно в два раза, когда ориентация электрического поля изменяется во время нанесения импульса, а жизнеспособность клеток не влияет. Увеличение трансфекции гена обусловлена увеличением мембраны области, которая производится компетентным для ДНК вступления в клетке.
Abstract
Гена электропереноса является физический метод используется для доставки генов в клетки путем применения коротких и интенсивных электрических импульсов, которые вызывают дестабилизацию клеточных мембран, что делает ее проницаемой для небольших молекул и позволяет передачу больших молекул, таких как ДНК. Он представляет собой альтернативу вирусные векторы, из-за его безопасность, эффективность и простота применения. Для гена электропереноса различных электрических импульсов протоколы используются для того, чтобы достичь максимальной трансфекции генов, один из них меняет направления электрического поля и ориентацию в течение импульса доставки. Изменение направления электрического поля и ориентации увеличение мембранного области компетентным для ДНК вступления в клетке. В этом видео, мы демонстрируем различие в гене эффективность электропереноса, когда все импульсы поступают в том же направлении и когда импульсы передаются путем изменения альтернативно направления электрического поля и ориентацию. Для этого наконечник со встроенным электродов и высоковольтной прототип генератора, который позволяет изменять электрического поля в разных направлениях во время применения электрических импульсов, были использованы. Гена электропереноса эффективность определяется 24 часов после применения в качестве импульса число клеток, экспрессирующих зеленый флуоресцентный белок разделить с числом всех клеток. Результаты показывают, что ген трансфекции увеличивается, когда электрические поля при ориентации электрических доставки импульс изменился.
Protocol
Discussion
Гена электропереноса это универсальный метод биотехнологии, который позволяет передачу ДНК в клетки с помощью применения Короче говоря, высоковольтных электрических импульсов 3 и представляет собой более безопасную альтернативу вирусные векторы, из-за его безопасность, эффект…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана словенского агентства исследований (проект J2-9770, инфраструктурных IP-0510 центр и программы Р2-0249). Это видео представляет дополнительный материал для "Электропорация основе технологий и методов лечения" научно-практический семинар и аспирантуру, организованный факультет электротехники в университете Любляны, Словения. Авторы благодарят также DUSA Ходжич за любезно предоставленные плазмидной ДНК.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| HAM-F12 | PAA | E15-016 | culture medium |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| fetal bovine serum | PAA | A15-151 | |
| gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | antibiotic |
| crystacilin | Pliva | 625110 | antibiotic |
| pEGFP-N1 | Clontech Laboratories | 6085-1 | plasmid DNA |
| HiSpeed Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12662 | |
| Na2HPO4 | Merck | F640786 933 | |
| NaH2PO4 | TKI Hrastnik | 0795 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M-8266 | |
| sucrose | Sigma-Aldrich | 16104 | |
| trypsin/EDTA solution | Sigma-Aldrich | T4174 | |
| pipette tip | Custom made | ||
| electric pulse generator | Custom made | ||
| 6 well plate | TPP | 92406 | |
| 15 ml centrifuge tube | TPP | 91015 | |
| 75 cm2 culture flask | TPP | 90076 |
References
- Rebersek, M. Electroporator with automatic change of electric field direction improves gene electrotransfer in-vitro. Biomed Eng Online. 6, 25-25 (2007).
- Trontelj, K., Rebersek, M., Miklavcic, D. Tip electrode chamber for small volume electroporation, electrofusion, and gene transfection. 18, (2006).
- Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. EMBO J. 1, 841-841 (1982).
- Daud, A. Phase I trial of interleukin-12 plasmid electroporation in patients with metastatic melanoma. J Clin Oncol. 26, 5896-5903 (2008).
- Pavlin, M., Miklavcic, D. Effective conductivity of a suspension of permeabilized cells: a theoretical analysis. Biophys J. 85, 719-729 (2003).
- Xie, T., Sun, L., Zhao, H., Fuchs, J., Tsong, T. Study of mechanisms of electric field-induced DNA transfection. IV. Effects of DNA topology on cell uptake and transfection efficiency. Biophys J. 63, 1026-1031 (1992).
- Rols, M., Delteil, C., Serin, G., Teissie, J. Temperature effects on electrotransfection of mammalian cells. Nucleic Acids Res. 22, 540-540 (1994).
- Golzio, M., Teissie, J., Rols, M. Cell synchronization effect on mammalian cell permeabilization and gene delivery by electric field. Biochim Biophys Acta. 1563, 23-28 (2002).
- Haberl, S., Miklavcic, D., Pavlin, M. Effect of Mg ions on efficiency of gene electrotransfer and on cell electropermeabilization. Bioelectrochemistry. 79, 265-271 (2010).
- Rols, M., Teissie, J. Electropermeabilization of mammalian cells to macromolecules: control by pulse duration. Biophys J. 75, 1415-1423 (1998).
- Kanduser, M., Miklavcic, D., Pavlin, M. Mechanisms involved in gene electrotransfer using high-and low-voltage pulses-An in vitro study. Bioelectrochemistry. 74, 265-271 (2009).
- Pavlin, M., Flisar, K., Kanduser, M. The role of electrophoresis in gene electrotransfer. J Membr Biol. 236, 75-79 (2010).
- Sersa, G., Cemazar, M., Semrov, D., Miklavcic, D. Changing electrode orientation improves the efficacy of electrochemotherapy of solid tumors in mice. Bioelectrochem Bioenerg. 39, 61-66 (1996).
- Faurie, C. Electro-mediated gene transfer and expression are controlled by the life-time of DNA/membrane complex formation. J Gene Med. 12, 117-125 (2010).
