Гена трансфекции электропорацией улучшается примерно в два раза, когда ориентация электрического поля изменяется во время нанесения импульса, а жизнеспособность клеток не влияет. Увеличение трансфекции гена обусловлена увеличением мембраны области, которая производится компетентным для ДНК вступления в клетке.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Изменение направления и ориентации электрического поля во время применения электрических импульсов Улучшает плазмиды перенос генов В пробирке
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Гена электропереноса является физический метод используется для доставки генов в клетки путем применения коротких и интенсивных электрических импульсов, которые вызывают дестабилизацию клеточных мембран, что делает ее проницаемой для небольших молекул и позволяет передачу больших молекул, таких как ДНК. Он представляет собой альтернативу вирусные векторы, из-за его безопасность, эффективность и простота применения. Для гена электропереноса различных электрических импульсов протоколы используются для того, чтобы достичь максимальной трансфекции генов, один из них меняет направления электрического поля и ориентацию в течение импульса доставки. Изменение направления электрического поля и ориентации увеличение мембранного области компетентным для ДНК вступления в клетке. В этом видео, мы демонстрируем различие в гене эффективность электропереноса, когда все импульсы поступают в том же направлении и когда импульсы передаются путем изменения альтернативно направления электрического поля и ориентацию. Для этого наконечник со встроенным электродов и высоковольтной прототип генератора, который позволяет изменять электрического поля в разных направлениях во время применения электрических импульсов, были использованы. Гена электропереноса эффективность определяется 24 часов после применения в качестве импульса число клеток, экспрессирующих зеленый флуоресцентный белок разделить с числом всех клеток. Результаты показывают, что ген трансфекции увеличивается, когда электрические поля при ориентации электрических доставки импульс изменился.
Протокол
1. Клеточные культуры, плазмиды и буферных подготовки к эксперименту
- В этом эксперименте яичника китайского хомячка клеток (СНО-К1) используются. Клетки, выращенные в питательной смеси HAM-F12 (ПАА) с добавлением 2 мМ L-глутамина, 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 400 мкл / л гентамицина (все от Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen, Германия), и 1 мл / л crystacilin (Плива, Загреб, Хорватия). Клетки хранятся при температуре 37 ° С в увлажненной 5% CO 2 в атмосферу инкубатора в течение 24 часов.
- Amplify плазмиды pEGFP-N1 (Clontech Laboratories, Inc, Mountain View, Калифорния, США), кодирующий зеленый флуоресцентный белок (GFP) в D....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Гена электропереноса это универсальный метод биотехнологии, который позволяет передачу ДНК в клетки с помощью применения Короче говоря, высоковольтных электрических импульсов 3 и представляет собой более безопасную альтернативу вирусные векторы, из-за его безопасность, эффективность и простота применения. Хотя электропереноса сегодня ген широко используется для трансфекции всех типов клеток и первый этап клинических испытаний с помощью этого метода было сообщено 4, основные механизмы до сих пор не .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нет конфликта интересов объявлены.
Благодарности
Эта работа была поддержана словенского агентства исследований (проект J2-9770, инфраструктурных IP-0510 центр и программы Р2-0249). Это видео представляет дополнительный материал для "Электропорация основе технологий и методов лечения" научно-практический семинар и аспирантуру, организованный факультет электротехники в университете Любляны, Словения. Авторы благодарят также DUSA Ходжич за любезно предоставленные плазмидной ДНК.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Название реагента | Компания | Номер в каталоге | Комментарии |
| HAM-F12 | ПАА | E15-016 | культуральной среде |
| L-глютамин | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| эмбриональной телячьей сыворотки | ПАА | А15-151 | |
| гентамицин | Sigma-Aldrich | G1397 | антибиотик |
| crystacilin | Плива | 625110 | антибиотик |
| pEGFP-N1 | Clontech лаборатории | 6085-1 | ДНК плазмиды |
| HiSpeed плазмиды Комплект Maxi | Qiagen | 12662 | |
| Na 2 HPO 4 | Merck | F640786 933 | |
| NaH 2 PO 4 | ИТК Храстник | 0795 | |
| MgCl 2 | Sigma-Aldrich | M-8266 | |
| сахарозы | Sigma-Aldrich | 16104 | |
| трипсин / ЭДТА решение | Sigma-Aldrich | T4174 | |
| пипетки | На заказ | ||
| электрический генератор импульсов | На заказ | ||
| 6 лунками | ТЭС | 92406 | |
| 15 мл центрифужную пробирку | ТЭС | 91015 | |
| 75 см 2 культуру колбу | ТЭС | 90076 |
Ссылки
- Rebersek, M. Electroporator with automatic change of electric field direction improves gene electrotransfer in-vitro. Biomed Eng Online. 6, 25-25 (2007).
- Trontelj, K., Rebersek, M., Miklavcic, D. Tip electrode chamber for sma....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
