Elektrik Bakliyat Uygulama sırasında Yön ve Elektrik Alan yönelimi değiştirme Plazmid Gen Transferi artırır In vitro</em
Summary
Darbe uygulama sırasında elektrik alanın yönü değiştiğinde elektroporasyon Gen transfeksiyon yaklaşık iki kat artar, hücre canlılığı etkilenen değildir. Gen transfeksiyon artış hücre içine DNA giriş için yetkili yapılır membran alanı artışı neden olur.
Abstract
Gene electrotransfer küçük moleküllere geçirgen hücre zarı istikrarsızlaştırma neden kısa ve yoğun elektrik bakliyat, uygulama hücrelerin içine genleri teslim etmek için kullanılan fiziksel bir yöntemdir ve DNA gibi büyük moleküllerin transferi sağlar. Bu viral vektörlerin, güvenlik, etkinlik ve uygulama kolaylığı nedeniyle alternatif bir temsil eder. Gen electrotransfer için farklı elektrik nabız protokolleri bunlardan biri darbe doğum sırasında, elektrik alanın yönü ve yönlendirmesi değişiyor, maksimum gen transfeksiyon elde etmek için kullanılır. Elektrik alanın yönü ve yönünün değiştirilmesi hücre içine DNA giriş için yetkili membran alanını artırmak. Bu video, tüm bakliyat aynı yönde teslim edilir ve bakliyat alternatif elektrik alanın yönü ve yönünü değiştirerek teslim edildiğinde gen electrotransfer etkinliği farklılık göstermektedir. Entegre elektrotlar ve elektrik nabız uygulama sırasında farklı yönlere elektrik alan değişimi sağlayan yüksek gerilim prototip jeneratör, bu amaçla ucu için kullanılmıştır. Gene electrotransfer etkinliği, tüm hücrelerin sayısı ile bölünmüş yeşil flüoresan protein eksprese eden hücrelerin sayısı olarak darbe uygulaması 24 saat sonra tespit edilir. Elektrik nabız teslimat sırasında elektrik alan yönü değiştiğinde gen transfeksiyon arttığını göstermektedir.
Protocol
Discussion
Gene electrotransfer kısa, yüksek gerilim elektrik darbeleri 3 uygulanması yoluyla hücre içine DNA transferi sağlar ve güvenilirliği, etkinliği ve uygulama kolaylığı nedeniyle viral vektörlerin daha güvenli bir alternatif temsil eden çok yönlü bir biyoteknoloji tekniktir . Bugün gen electrotransfer 4 bildirilmiştir hücreleri ve ilk aşaması bu yöntemi kullanarak her türlü klinik çalışma transfect yaygın kullanılmasına rağmen, altta yatan mekanizmalar hala tam olarak a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Slovenya Araştırma Ajansı (proje J2-9770, altyapı merkezi IP-0510 ve program P2-0249) tarafından desteklenmiştir. Bu video "Elektroporasyon tabanlı Teknolojileri ve Tedaviler", Slovenya Ljubljana Üniversitesi Elektrik Mühendisliği Fakültesi tarafından düzenlenen bilimsel atölye ve lisansüstü ders, ek malzeme temsil eder. Yazarlar nazik plazmid DNA sağlamak için de DUSA Hodzic teşekkür ederiz.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| HAM-F12 | PAA | E15-016 | culture medium |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| fetal bovine serum | PAA | A15-151 | |
| gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | antibiotic |
| crystacilin | Pliva | 625110 | antibiotic |
| pEGFP-N1 | Clontech Laboratories | 6085-1 | plasmid DNA |
| HiSpeed Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12662 | |
| Na2HPO4 | Merck | F640786 933 | |
| NaH2PO4 | TKI Hrastnik | 0795 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M-8266 | |
| sucrose | Sigma-Aldrich | 16104 | |
| trypsin/EDTA solution | Sigma-Aldrich | T4174 | |
| pipette tip | Custom made | ||
| electric pulse generator | Custom made | ||
| 6 well plate | TPP | 92406 | |
| 15 ml centrifuge tube | TPP | 91015 | |
| 75 cm2 culture flask | TPP | 90076 |
References
- Rebersek, M. Electroporator with automatic change of electric field direction improves gene electrotransfer in-vitro. Biomed Eng Online. 6, 25-25 (2007).
- Trontelj, K., Rebersek, M., Miklavcic, D. Tip electrode chamber for small volume electroporation, electrofusion, and gene transfection. 18, (2006).
- Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. EMBO J. 1, 841-841 (1982).
- Daud, A. Phase I trial of interleukin-12 plasmid electroporation in patients with metastatic melanoma. J Clin Oncol. 26, 5896-5903 (2008).
- Pavlin, M., Miklavcic, D. Effective conductivity of a suspension of permeabilized cells: a theoretical analysis. Biophys J. 85, 719-729 (2003).
- Xie, T., Sun, L., Zhao, H., Fuchs, J., Tsong, T. Study of mechanisms of electric field-induced DNA transfection. IV. Effects of DNA topology on cell uptake and transfection efficiency. Biophys J. 63, 1026-1031 (1992).
- Rols, M., Delteil, C., Serin, G., Teissie, J. Temperature effects on electrotransfection of mammalian cells. Nucleic Acids Res. 22, 540-540 (1994).
- Golzio, M., Teissie, J., Rols, M. Cell synchronization effect on mammalian cell permeabilization and gene delivery by electric field. Biochim Biophys Acta. 1563, 23-28 (2002).
- Haberl, S., Miklavcic, D., Pavlin, M. Effect of Mg ions on efficiency of gene electrotransfer and on cell electropermeabilization. Bioelectrochemistry. 79, 265-271 (2010).
- Rols, M., Teissie, J. Electropermeabilization of mammalian cells to macromolecules: control by pulse duration. Biophys J. 75, 1415-1423 (1998).
- Kanduser, M., Miklavcic, D., Pavlin, M. Mechanisms involved in gene electrotransfer using high-and low-voltage pulses-An in vitro study. Bioelectrochemistry. 74, 265-271 (2009).
- Pavlin, M., Flisar, K., Kanduser, M. The role of electrophoresis in gene electrotransfer. J Membr Biol. 236, 75-79 (2010).
- Sersa, G., Cemazar, M., Semrov, D., Miklavcic, D. Changing electrode orientation improves the efficacy of electrochemotherapy of solid tumors in mice. Bioelectrochem Bioenerg. 39, 61-66 (1996).
- Faurie, C. Electro-mediated gene transfer and expression are controlled by the life-time of DNA/membrane complex formation. J Gene Med. 12, 117-125 (2010).
