Roterende Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human trofoblasten celler som en model
Summary
Traditionel, todimensionale cellekultur teknikker ofte resultere i ændrede egenskaber med hensyn til differentiering markører, cytokiner og vækstfaktorer. Tre-dimensionel cellekultur i den roterende cellekultur-system (RCCS) genopretter udtryk for mange af disse faktorer, som vist her med en extravillous trofoblasten cellelinje.
Abstract
Feltet af menneskelige trofoblasten forskning aids i at forstå den komplekse miljø etableret i løbet placentation. På grund af arten af disse undersøgelser, humane in vivo eksperimenter er umuligt. En kombination af primære kulturer, eksplantation kulturer og trofoblasten cellelinier 1 Støtte vores forståelse af invasion af livmodervæggen 2 og ombygning af uterin spiral arterier 3,4 af extravillous trofoblasten celler (EVTs), som er nødvendig for en vellykket etablering af graviditeten. På trods af den rigdom af viden hentet fra sådanne modeller, er det accepteret, at in vitro-cellekultur modeller ved hjælp af EVT-lignende celle linjers display ændrede cellulære egenskaber i forhold til deres in vivo modstykker 5,6. Cellerne dyrkes i den roterende cellekultur-system (RCCS) display morfologiske, fænotypisk, og funktionelle egenskaber af EVT-lignende celle linjer, der i højere grad efterligner differentiere i uTero EVTs, med øget ekspression af gener medierende invasion (f.eks matrixmetalloproteinaser (MMPs)) og trofoblasten differentiering 7,8,9. Saint Georges Hospital Placental cellelinie-4 (SGHPL-4) (venligst doneret af Dr. Guy Whitley og Dr. Judith Cartwright) er en EVT-lignende cellelinie, der blev brugt til test i RCCS.
Udformningen af RCCS kultur skib er baseret på princippet om, at organer og væv fungerer i en tre-dimensionel (3-D) miljø. På grund af de dynamiske dyrkningsbetingelser i skibet, herunder betingelser for fysiologisk relevante shear, celler dyrket i tre dimensioner danner aggregater baseret på naturlige cellulære tilhørsforhold og differentiere sig til organotypiske væv-agtige forsamlinger 10,11,12. Opretholdelse af en væske bane giver en lav-forskydning, lav turbulens miljø, der svarer til tilstande, der findes in vivo. Sedimentation af dyrkede celler er imødegås ved at justere rotationenhastighed RCCS at sikre en konstant frit fald af celler. Gasbørs sker gennem et permeabelt hydrofob membran placeret på bagsiden af bioreaktor. Ligesom deres forældre væv in vivo, er RCCS-dyrket celler i stand til at reagere på kemiske og molekylær gradienter i tre dimensioner (dvs. på deres apikale, basale og laterale overflader), fordi de dyrkes på overfladen af porøse microcarrier perler. Når der dyrkes som to-dimensionelle monolag på befæstede arealer som plastik, er cellerne berøvet denne vigtige kommunikation på deres basale overflade. Derfor, den rumlige begrænsninger, som miljøet dybt indflydelse på, hvordan celler fornuft og afkode signaler fra det omgivende mikromiljø, hvilket antyder en vigtig rolle for de 3-D miljø 13.
Vi har brugt RCCS til ingeniør biologisk meningsfuld 3-D modeller af forskellige menneskelige epitelvæv 7,14,15,16. Mange tidligere rapporter har DEMonstrated at cellerne dyrkes i RCCS kan påtage sig fysiologisk relevante fænotyper, der ikke har været muligt med andre modeller 10,17-21. Sammenfattende repræsenterer kulturen i RCCS en nem, reproducerbar, high-throughput platform, der giver et stort antal af differentierede celler, der gøres til genstand for en bred vifte af eksperimentelle manipulationer. I det følgende protokol, ved hjælp EVTs som et eksempel vi klart beskrive de nødvendige skridt til tre-dimensionelt kultur klæbende celler i RCCS.
Protocol
Discussion
Kulturen Teknikken præsenteres her giver efterforskerne med yderst invasive EVT-lignende celler. Det er nu blevet anerkendt, at et tab af differentiering forekommer i monolag på grund af hæmning af cellulære reaktioner på kemiske og molekylære signaler i tre dimensioner (apikale, basale og lateral celleoverfladerne) 10,13. Denne teknik afspejler karakteristika bemærket i livmoderen på invaderende EVT celler. Da proceduren efterligner konventionelle éncellelag vævskultur tid kinetik, men giv…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af det amerikanske National Institutes of Health tilskud NIH / NICHD # HD051998 (til CAM).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Cytodex microcarrier beads | Sigma-Aldrich | C3275 | |
| Rotating Cell Culture System (RCCS) | Synthecon | RCCS-D | Includes rotor base, power supply, 4 disposable RCCS units |
| RCCS Disposable Units | Synthecon | Contact Synthecon | |
| 3ml Luer-Lock tip syringe | BD | 309585 | |
| 10ml wide-tip serological pipette | BD | 357504 | |
| MEM Alpha | Invitrogen | 12561-072 | |
| Leibovitz’s L-15 medium, powder | Invitrogen | 41300-039 | |
| H2O, Endotoxin free | Fisher | MT-25-055-CM | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S-7795 | |
| Peptone | Fisher Scientific | BP1420-100 | |
| Fructose | Sigma-Aldrich | F3510-100 | |
| Galactose | Sigma-Aldrich | G5388-100 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528-250 | |
| HEPES | Invitrogen | 15630-080 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | |
| Insulin-Transferrin-Sodium Selenite (ITS) | Sigma-Aldrich | I1884 | |
| FBS | Invitrogen | 10437 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140 |
References
- Knofler, M. Critical growth factors and signalling pathways controlling human trophoblast invasion. Int. J. Dev. Biol. 54, 269-269 (2010).
- Cartwright, J. E. Remodelling at the maternal-fetal interface: relevance to human pregnancy disorders. Reproduction. 140, 803-803 (2010).
- Harris, L. K. IFPA Gabor Than Award lecture: Transformation of the spiral arteries in human pregnancy: key events in the remodelling timeline. Placenta. 32, S154-S154 (2011).
- Whitley, G. S., Cartwright, J. E. Trophoblast-mediated spiral artery remodelling: a role for apoptosis. J. Anat. 215, 21-21 (2009).
- Apps, R. Genome-wide expression profile of first trimester villous and extravillous human trophoblast cells. Placenta. 32, 33-33 (2011).
- Bilban, M. Trophoblast invasion: assessment of cellular models using gene expression signatures. Placenta. 31, 989-989 (2010).
- LaMarca, H. L. Three-dimensional growth of extravillous cytotrophoblasts promotes differentiation and invasion. Placenta. 26, 709-709 (2005).
- Jovanovic, M., Stefanoska, I., Radojcic, L., Vicovac, L. Interleukin-8 (CXCL8) stimulates trophoblast cell migration and invasion by increasing levels of matrix metalloproteinase (MMP)2 and MMP9 and integrins alpha5 and beta1. Reproduction. 139, 789-789 (2010).
- Husslein, H. Expression, regulation and functional characterization of matrix metalloproteinase-3 of human trophoblast. Placenta. 30, 284-284 (2009).
- Barrila, J. Organotypic 3D cell culture models: using the rotating wall vessel to study host-pathogen interactions. Nat. Rev. Microbiol. 8, 791-791 (2010).
- Hammond, T. G., Hammond, J. M. Optimized suspension culture: the rotating-wall vessel. Am. J. Physiol. Renal. Physiol. 281, 12-12 (2001).
- Unsworth, B. R., Lelkes, P. I. Growing tissues in microgravity. Nat. Med. 4, 901-901 (1998).
- Schmeichel, K. L., Bissell, M. J. Modeling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions. J. Cell. Sci. 116, 2377-2377 (2003).
- Bentrup, H. ?. ?. n. e. r. z. u., K, . Three-dimensional organotypic models of human colonic epithelium to study the early stages of enteric salmonellosis. Microbes. Infect. 8, 1813-1813 (2006).
- Carterson, A. J. A549 lung epithelial cells grown as three-dimensional aggregates: alternative tissue culture model for Pseudomonas aeruginosa pathogenesis. Infect. Immun. 73, 1129-1129 (2005).
- Myers, T. A. Closing the phenotypic gap between transformed neuronal cell lines in culture and untransformed neurons. J. Neurosci. Methods. 174, 31-31 (2008).
- Hjelm, B. E. Development and characterization of a three-dimensional organotypic human vaginal epithelial cell model. Biol. Reprod. 82, 617-617 (2010).
- Straub, T. M. In vitro cell culture infectivity assay for human noroviruses. Emerg. Infect. Dis. 13, 396-396 (2007).
- Nickerson, C. A. Three-dimensional tissue assemblies: novel models for the study of Salmonella enterica serovar Typhimurium pathogenesis. Infect. Immun. 69, 7106-7106 (2001).
- Carvalho, H. M., Teel, L. D., Goping, G., O’Brien, A. D. A three-dimensional tissue culture model for the study of attach and efface lesion formation by enteropathogenic and enterohaemorrhagic Escherichia coli. Cell. Microbiol. 7, 1771-1771 (2005).
- Sainz, B., TenCate, V., Uprichard, S. L. Three-dimensional Huh7 cell culture system for the study of Hepatitis C virus infection. Virol. J. 6, 103-103 (2009).
- Lelkes, P. I., Ramos, E., Nikolaychik, V. V., Wankowski, D. M., Unsworth, B. R., Goodwin, T. J. GTSF-2: a new, versatile cell culture medium for diverse normal and transformed mammalian cells. In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim. 33, 344-344 (1997).
- Lelkes, P. I., Ramos, E., Nikolaychik, V. V., Wankowski, D. M., Unsworth, B. R., Goodwin, T. J. GTSF-2: a new, versatile cell culture medium for diverse normal and transformed mammalian cells. In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim. 33, 344-344 (1997).
- GE Healthcare. Microcarrier Cell Culture – Principles and Methods. Handbooks. , (2005).
