İnsan Hücre Kültürü Döner Hücre Kültür Sistemleri: Bir Model Olarak İnsan trofoblast Hücreleri
Summary
Geleneksel iki boyutlu hücre kültür teknikleri genellikle farklılaşma belirteçleri, sitokinler ve büyüme faktörleri açısından değişmiş özellikleri. Extravillous trofoblast hücre hattı ile burada gösterildiği gibi dönen hücre kültür sistemi Üç boyutlu hücre kültürü (RCC), bu faktörlerin çoğunun ifade yeniden kurar.
Abstract
Insan trofoblast araştırma alanında plasenta sırasında kurulan karmaşık bir ortamda anlama yardımcı olur. Bu çalışmalar doğası gereği, in vivo deney insan mümkün değildir. Primer kültürlerinde, eksplant kültürler ve trofoblast hücre hatları 1 bir arada rahim duvarına 2 işgali ve gebelik başarılı bir şekilde kurulması için gerekli olan extravillous trofoblast hücreleri (EVTs), rahim spiral arterler 3,4 remodeling anlayışımızı desteklemektedir. Bu modellerin toplanan bilginin zenginlik rağmen, in vivo meslektaşları 5,6 ile kıyaslandığında EVT gibi hücre hatları kullanılarak in vitro hücre kültür modelleri hücresel özellikleri değişmiş ekran kabul edilir. Dönen hücre kültür sistemi (RCC) kültür hücreler u daha yakından ayırt taklit EVT hücre hatları gibi, morfolojik, fenotipik ve fonksiyonel özellikleri görüntülerişgali (örneğin matriks metalloproteinazların (MMP)) ve trofoblast farklılaşma 7,8,9 aracılık genlerin artmış ekspresyonu ile Tero EVTs. Saint Georges Hastanesi Plasental hücre Line-4 (SGHPL 4) (nazik Dr Guy Whitley ve Dr. Judith Cartwright tarafından bağışlanan) RCC test etmek için kullanılan bir EVT gibi hücre hattı.
RCC kültür geminin tasarımı, organ ve dokuların üç boyutlu (3-D) bir ortamda işlev olduğu ilkesine dayanmaktadır. Fizyolojik ilgili kayma koşulları da dahil olmak üzere, üç boyutlu olarak yetişen gemi dinamik kültür koşulları, hücreler nedeniyle doğal hücresel yakınlık temelinde bir araya toplanırlar ve doku gibi meclisleri Organotipik 10,11,12 farklılaşırlar. In vivo koşullara benzer bir düşük kesme, düşük türbülans ortamında bir sıvı yörüngesinin bakım sağlar. Kültürlü hücrelerinin Sedimantasyon dönme ayarlayarak karşıhücrelerin sürekli bir serbest düşüş sağlamak için RCC hızı. Gaz değişimi biyoreaktör arkasında bulunan geçirgen bir hidrofobik zarından oluşur. Ebeveyn in vivo doku gibi, RCC yetiştirilen hücreler, gözenekli microcarrier boncuk yüzey kültüre, çünkü üç boyutlu (yani, apikal, bazal ve lateral yüzeylerde), kimyasal ve moleküler gradyanlar yanıt vermek mümkün. Plastik gibi geçirimsiz yüzeylerde iki boyutlu mono tabakaları gibi büyüdüğü zaman, hücreler bazal yüzeyindeki bu önemli iletişim yoksun. Sonuç olarak, çevreye dayattığı mekansal kısıtlamalar derinden, böylece 3-D ortam 13 için önemli bir rol ima hücreleri çevreleyen mikroçevresinin duygusu ve decode sinyalleri nasıl etkileyecek.
Biz, çeşitli insan epitel dokuların 7,14,15,16 biyolojik olarak anlamlı bir 3-D modellerin mühendisi RCC kullandık . Gerçekten de, çok daha önceki raporlarda demRCC kültür hücreleri diğer modelleri 10,17-21 mümkün olmayan fizyolojik ilgili fenotipleri varsayabiliriz hücre dizilerindeki ardışık. Özet olarak, RCC kültür farklılaşmış hücrelerin çeşitli deneysel manipülasyon için uygun olan çok sayıda sağlayan kolay, tekrarlanabilir, yüksek verimli bir platformu temsil eder. Aşağıdaki protokol, bir örnek olarak EVTs kullanarak, açıkça RCC üç boyutlu kültür yapışık hücreleri için gerekli adımları tanımlamak.
Protocol
Discussion
Burada sunulan kültür tekniği son derece invaziv EVT-benzeri hücreler ile araştırmacılar sağlar. Şimdi farklılaşma kaybı hücresel yanıtları, üç boyutlu (apikal, bazal ve lateral hücre yüzeylerinde) 10,13 kimyasal ve moleküler ipuçları inhibisyonu nedeniyle mono tabakaları oluşur kabul edilmiştir . Bu teknik EVT hücreleri istila in utero not özelliklerini yansıtır. Prosedür geleneksel tek tabakalı doku kültürü zaman kinetiği taklit eder, ancak diferansiyel ifadesi il…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, ABD Ulusal Sağlık hibe NIH / NICHD # HD051998 (CAM) Enstitüleri tarafından da desteklenmiştir.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Cytodex microcarrier beads | Sigma-Aldrich | C3275 | |
| Rotating Cell Culture System (RCCS) | Synthecon | RCCS-D | Includes rotor base, power supply, 4 disposable RCCS units |
| RCCS Disposable Units | Synthecon | Contact Synthecon | |
| 3ml Luer-Lock tip syringe | BD | 309585 | |
| 10ml wide-tip serological pipette | BD | 357504 | |
| MEM Alpha | Invitrogen | 12561-072 | |
| Leibovitz’s L-15 medium, powder | Invitrogen | 41300-039 | |
| H2O, Endotoxin free | Fisher | MT-25-055-CM | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S-7795 | |
| Peptone | Fisher Scientific | BP1420-100 | |
| Fructose | Sigma-Aldrich | F3510-100 | |
| Galactose | Sigma-Aldrich | G5388-100 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528-250 | |
| HEPES | Invitrogen | 15630-080 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | |
| Insulin-Transferrin-Sodium Selenite (ITS) | Sigma-Aldrich | I1884 | |
| FBS | Invitrogen | 10437 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140 |
References
- Knofler, M. Critical growth factors and signalling pathways controlling human trophoblast invasion. Int. J. Dev. Biol. 54, 269-269 (2010).
- Cartwright, J. E. Remodelling at the maternal-fetal interface: relevance to human pregnancy disorders. Reproduction. 140, 803-803 (2010).
- Harris, L. K. IFPA Gabor Than Award lecture: Transformation of the spiral arteries in human pregnancy: key events in the remodelling timeline. Placenta. 32, S154-S154 (2011).
- Whitley, G. S., Cartwright, J. E. Trophoblast-mediated spiral artery remodelling: a role for apoptosis. J. Anat. 215, 21-21 (2009).
- Apps, R. Genome-wide expression profile of first trimester villous and extravillous human trophoblast cells. Placenta. 32, 33-33 (2011).
- Bilban, M. Trophoblast invasion: assessment of cellular models using gene expression signatures. Placenta. 31, 989-989 (2010).
- LaMarca, H. L. Three-dimensional growth of extravillous cytotrophoblasts promotes differentiation and invasion. Placenta. 26, 709-709 (2005).
- Jovanovic, M., Stefanoska, I., Radojcic, L., Vicovac, L. Interleukin-8 (CXCL8) stimulates trophoblast cell migration and invasion by increasing levels of matrix metalloproteinase (MMP)2 and MMP9 and integrins alpha5 and beta1. Reproduction. 139, 789-789 (2010).
- Husslein, H. Expression, regulation and functional characterization of matrix metalloproteinase-3 of human trophoblast. Placenta. 30, 284-284 (2009).
- Barrila, J. Organotypic 3D cell culture models: using the rotating wall vessel to study host-pathogen interactions. Nat. Rev. Microbiol. 8, 791-791 (2010).
- Hammond, T. G., Hammond, J. M. Optimized suspension culture: the rotating-wall vessel. Am. J. Physiol. Renal. Physiol. 281, 12-12 (2001).
- Unsworth, B. R., Lelkes, P. I. Growing tissues in microgravity. Nat. Med. 4, 901-901 (1998).
- Schmeichel, K. L., Bissell, M. J. Modeling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions. J. Cell. Sci. 116, 2377-2377 (2003).
- Bentrup, H. ?. ?. n. e. r. z. u., K, . Three-dimensional organotypic models of human colonic epithelium to study the early stages of enteric salmonellosis. Microbes. Infect. 8, 1813-1813 (2006).
- Carterson, A. J. A549 lung epithelial cells grown as three-dimensional aggregates: alternative tissue culture model for Pseudomonas aeruginosa pathogenesis. Infect. Immun. 73, 1129-1129 (2005).
- Myers, T. A. Closing the phenotypic gap between transformed neuronal cell lines in culture and untransformed neurons. J. Neurosci. Methods. 174, 31-31 (2008).
- Hjelm, B. E. Development and characterization of a three-dimensional organotypic human vaginal epithelial cell model. Biol. Reprod. 82, 617-617 (2010).
- Straub, T. M. In vitro cell culture infectivity assay for human noroviruses. Emerg. Infect. Dis. 13, 396-396 (2007).
- Nickerson, C. A. Three-dimensional tissue assemblies: novel models for the study of Salmonella enterica serovar Typhimurium pathogenesis. Infect. Immun. 69, 7106-7106 (2001).
- Carvalho, H. M., Teel, L. D., Goping, G., O’Brien, A. D. A three-dimensional tissue culture model for the study of attach and efface lesion formation by enteropathogenic and enterohaemorrhagic Escherichia coli. Cell. Microbiol. 7, 1771-1771 (2005).
- Sainz, B., TenCate, V., Uprichard, S. L. Three-dimensional Huh7 cell culture system for the study of Hepatitis C virus infection. Virol. J. 6, 103-103 (2009).
- Lelkes, P. I., Ramos, E., Nikolaychik, V. V., Wankowski, D. M., Unsworth, B. R., Goodwin, T. J. GTSF-2: a new, versatile cell culture medium for diverse normal and transformed mammalian cells. In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim. 33, 344-344 (1997).
- Lelkes, P. I., Ramos, E., Nikolaychik, V. V., Wankowski, D. M., Unsworth, B. R., Goodwin, T. J. GTSF-2: a new, versatile cell culture medium for diverse normal and transformed mammalian cells. In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim. 33, 344-344 (1997).
- GE Healthcare. Microcarrier Cell Culture – Principles and Methods. Handbooks. , (2005).
