Rotation systèmes de culture cellulaire de la culture de cellules humaines: les cellules du trophoblaste humain comme modèle
Summary
Traditionnel, en deux dimensions techniques de culture cellulaire entraînent souvent des caractéristiques modifiées par rapport aux marqueurs de différenciation, de cytokines et de facteurs de croissance. Culture cellulaire en trois dimensions dans le système de culture cellulaire en rotation (CRCT) rétablit l'expression de plusieurs de ces facteurs comme montré ici avec une lignée de cellules trophoblastiques extravilleux.
Abstract
Le domaine de la recherche trophoblaste humain aide à comprendre l'environnement complexe créé pendant la placentation. En raison de la nature de ces études, l'expérimentation in vivo humaine est impossible. Une combinaison de cultures primaires, des cultures d'explants et des lignées cellulaires trophoblastiques une aide notre compréhension de l'invasion de la paroi utérine 2 et le remodelage des artères utérines 3,4 spirale par les cellules trophoblastiques extravilleux (TTE), qui est nécessaire à l'établissement réussi de la grossesse. Malgré la richesse des connaissances glanées ces modèles, il est admis que dans les modèles de culture cellulaire in vitro utilisant des lignées cellulaires EVT-comme l'affichage altéré les propriétés cellulaires par rapport à leurs homologues de 5,6 vivo. Les cellules cultivées dans le système de culture cellulaire en rotation (CRCT) afficher les propriétés morphologiques, phénotypiques et fonctionnelles des lignées cellulaires EVT-like qui imitent plus étroitement de différenciation dans uTTE tero, avec une expression accrue des gènes de l'invasion de médiation (par exemple, les métalloprotéases matricielles (MMP)) et 7,8,9 de différenciation du trophoblaste. L'Hôpital Saint-Georges de cellules placentaires Ligne-4 (SGHPL-4) (fournie gracieusement par le Dr Guy Whitley et la Dre Judith Cartwright) est une lignée cellulaire EVT-like qui a été utilisé pour les essais dans le CRCT.
La conception du récipient de culture CRCT est basé sur le principe que les organes et tissus de fonction dans une des trois dimensions (3-D) environnement. En raison des conditions de culture dynamique dans le navire, y compris des conditions de cisaillement physiologiquement pertinents, les cellules cultivées en trois dimensions forment des agrégats basés sur les affinités naturelles cellulaire et se différencier en tissus organotypiques-like assemblées 10,11,12. Le maintien d'une orbite de liquide fournit une faible cisaillement, faible turbulence environnement similaire aux conditions rencontrées in vivo. Sédimentation des cellules cultivées est contré par l'ajustement de la rotationvitesse de la CRCT pour assurer une constante chute libre des cellules. Les échanges gazeux se produit à travers une membrane hydrophobe perméable située à l'arrière du bioréacteur. Comme leurs parents tissus in vivo, CRCT cellules cultivées sont capables de répondre aux gradients chimiques et moléculaires en trois dimensions (c'est à dire à leurs surfaces apicale, basale et latérale), parce qu'ils sont cultivés sur la surface de billes de microsupport poreux. Lorsqu'il est cultivé comme deux dimensions monocouches sur des surfaces imperméables comme le plastique, les cellules sont privés de cette communication importante à leur surface basale. Par conséquent, les contraintes spatiales imposées par l'environnement affectent profondément la manière dont le sens et les signaux des cellules du microenvironnement décoder environnantes, ce qui implique un rôle important pour le milieu en 3-D 13.
Nous avons utilisé le CRCT à l'ingénieur biologiquement significative modèles 3-D des différents tissus épithéliaux humains 7,14,15,16. En effet, de nombreux rapports précédents ont demonstrated que les cellules cultivées dans le CRCT peut supposer phénotypes physiologiquement pertinents qui n'ont pas été possibles avec d'autres modèles 10,17-21. En résumé, la culture dans le CRCT représente un moyen facile, reproductibles, à haut débit plateforme qui fournit un grand nombre de cellules différenciées qui se prêtent à une variété de manipulations expérimentales. Dans le protocole suivant, en utilisant TTE comme un exemple, nous décrivent clairement les étapes nécessaires à la culture de cellules en trois dimensions adhérente à la CRCT.
Protocol
Discussion
La technique de la culture présentées ici fournit aux enquêteurs hautement invasive EVT-comme les cellules. Il a maintenant été reconnu que la perte de la différenciation se produit dans les monocouches due à l'inhibition des réponses cellulaires aux signaux chimiques et moléculaires dans les trois dimensions (surface des cellules apicales, basales et latérales) 10,13. Cette technique reflète les caractéristiques noté in utero sur l'invasion des cellules TEV. Comme la procédure …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par les Instituts nationaux américains de la Santé subvention du NIH / NICHD # HD051998 (au CAM).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Cytodex microcarrier beads | Sigma-Aldrich | C3275 | |
| Rotating Cell Culture System (RCCS) | Synthecon | RCCS-D | Includes rotor base, power supply, 4 disposable RCCS units |
| RCCS Disposable Units | Synthecon | Contact Synthecon | |
| 3ml Luer-Lock tip syringe | BD | 309585 | |
| 10ml wide-tip serological pipette | BD | 357504 | |
| MEM Alpha | Invitrogen | 12561-072 | |
| Leibovitz’s L-15 medium, powder | Invitrogen | 41300-039 | |
| H2O, Endotoxin free | Fisher | MT-25-055-CM | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S-7795 | |
| Peptone | Fisher Scientific | BP1420-100 | |
| Fructose | Sigma-Aldrich | F3510-100 | |
| Galactose | Sigma-Aldrich | G5388-100 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528-250 | |
| HEPES | Invitrogen | 15630-080 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | |
| Insulin-Transferrin-Sodium Selenite (ITS) | Sigma-Aldrich | I1884 | |
| FBS | Invitrogen | 10437 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140 |
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