Summary

Rotación de sistemas de cultivos celulares de cultivo de células humanas: células humanas trofoblásticas como un modelo de

Published: January 18, 2012
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Summary

Tradicional de dos dimensiones técnicas de cultivo de células a menudo resultan en características alteradas con respecto a los marcadores de diferenciación, citoquinas y factores de crecimiento. En tres dimensiones de cultivo de células en el sistema de rotación de cultivo celular (RCC) restablece la expresión de muchos de estos factores, como se muestra aquí con una línea de células trofoblásticas extravelloso.

Abstract

El campo de la investigación trofoblasto humano ayuda a comprender el complejo entorno establecido durante la placentación. Debido a la naturaleza de estos estudios, humanos en la experimentación in vivo es imposible. Una combinación de cultivos primarios, cultivos de explantes y las líneas de células del trofoblasto 1 para comprender mejor la invasión de la pared uterina 2 y remodelación de las arterias espirales uterinas por las células del trofoblasto 3,4 extravelloso (EVTS), que se requiere para el éxito del embarazo. A pesar de la riqueza de los conocimientos obtenidos de estos modelos, se acepta que en los modelos de cultivo celular in vitro utilizando EVT-como líneas celulares de pantalla alteración de las propiedades celulares en comparación con sus contrapartes en vivo 5,6. Las células cultivadas en el sistema de rotación de cultivo celular (RCC) mostrar las propiedades morfológicas, fenotípicas y funcionales de las líneas celulares EVT-como el que más se asemejan mucho en la diferenciación utero EVTS, con el aumento de expresión de los genes de la mediación invasión (por ejemplo, metaloproteinasas de matriz (MMP)) y la diferenciación del trofoblasto 7,8,9. El Hospital de Saint-Georges-de células placentarias Línea-4 (SGHPL-4) (donado amablemente por el Dr. Guy Whitley y la Dra. Judith Cartwright) es una línea de células EVT-como el que se utilizó para las pruebas de la RCC.

El diseño del recipiente de cultivo RCC se basa en el principio de que los órganos y tejidos en función de tres dimensiones (3-D) el medio ambiente. Debido a las condiciones de cultivo en la dinámica del buque, incluidas las condiciones de corte fisiológicamente relevantes, las células cultivadas en tres dimensiones forman agregados basados ​​en afinidades naturales celular y diferenciarse en tejidos como organotípicos asambleas 10,11,12. El mantenimiento de una órbita fluido proporciona un bajo cizallamiento, baja turbulencia entorno similar a las encontradas en vivo. Sedimentación de las células cultivadas se ve contrarrestada por el ajuste de la rotaciónvelocidad de la RCC para asegurar una constante caída libre de las células. El intercambio gaseoso ocurre a través de una membrana permeable hidrofóbica en la parte posterior del biorreactor. Al igual que sus padres en el tejido vivo, RCC células cultivadas son capaces de responder a los químicos y los gradientes moleculares en tres dimensiones (es decir, en su superficie apical, basal y lateral), ya que se cultivan en la superficie de cuentas microportadores porosa. Cuando se cultiva en dos dimensiones monocapas sobre superficies impermeables como el plástico, las células se ven privadas de esta importante comunicación en su superficie basal. En consecuencia, las limitaciones espaciales impuestas por el medio ambiente afectan profundamente a cómo el sentido y las señales de las células de decodificar el microambiente que rodea, lo que implica un papel importante para el medio en 3-D 13.

Hemos utilizado la RCC para diseñar biológicamente significativos modelos 3-D de diversos tejidos epiteliales humanas 7,14,15,16. De hecho, muchos informes anteriores han demonstrated que las células cultivadas en el RCC puede asumir fenotipos fisiológicamente relevantes que no han sido posible con otros modelos 10,17-21. En resumen, la cultura de la RCC representa una forma fácil, reproducible y de alto rendimiento plataforma que ofrece un gran número de células diferenciadas que son susceptibles a una variedad de manipulaciones experimentales. En el siguiente protocolo, utilizando EVTS como ejemplo, que describa claramente los pasos necesarios para cultivar células en tres dimensiones adherentes en la RCC.

Protocol

1. Preparación de bolas de colágeno Antes de EVTS de carga para 3-D de cultivo de células, se necesita para preparar las cuentas microportadores Cytodex-3: Pesar la cantidad apropiada de Cytodex-3 cuentas necesarios para el experimento. Este protocolo está adaptado para el vaso de 10 ml RCC, en la que 0,05 g de granos se necesitan. Para que un buque 50ml RCC, la escala correspondiente. En un tubo cónico de 50 ml autoclavable, mezclar 250 mg Cytodex-3 perlas con 12 ml de fosfato tamponado Dulbecc…

Discussion

La técnica de cultivo que aquí se presenta proporciona a los investigadores altamente invasiva EVT-como las células. Ahora se ha reconocido que la pérdida de la diferenciación se produce en monocapas debido a la inhibición de la respuesta celular a agentes químicos y señales moleculares en tres dimensiones (la superficie celular apical, basal y lateral) 10,13. Esta técnica refleja características señaladas en el útero de invadir las células EVT. Como el procedimiento convencional imita e…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por los EE.UU. Institutos Nacionales de Salud de subvención del NIH / NICHD # HD051998 (de CAM).

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments
Cytodex microcarrier beads Sigma-Aldrich C3275  
Rotating Cell Culture System (RCCS) Synthecon RCCS-D Includes rotor base, power supply, 4 disposable RCCS units
RCCS Disposable Units Synthecon Contact Synthecon  
3ml Luer-Lock tip syringe BD 309585  
10ml wide-tip serological pipette BD 357504  
MEM Alpha Invitrogen 12561-072  
Leibovitz’s L-15 medium, powder Invitrogen 41300-039  
H2O, Endotoxin free Fisher MT-25-055-CM  
Sodium Bicarbonate Sigma-Aldrich S-7795  
Peptone Fisher Scientific BP1420-100  
Fructose Sigma-Aldrich F3510-100  
Galactose Sigma-Aldrich G5388-100  
Glucose Sigma-Aldrich G7528-250  
HEPES Invitrogen 15630-080  
L-Glutamine Invitrogen 25030  
Insulin-Transferrin-Sodium Selenite (ITS) Sigma-Aldrich I1884  
FBS Invitrogen 10437  
Penicillin-Streptomycin Invitrogen 15140  

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Zwezdaryk, K. J., Warner, J. A., Machado, H. L., Morris, C. A., Höner zu Bentrup, K. Rotating Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human Trophoblast Cells as a Model. J. Vis. Exp. (59), e3367, doi:10.3791/3367 (2012).

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