Selektiv Viral Transduksjon of Adult-fødte olfactory Neurons for Chronic In vivo Optogenetic Stimulering
Summary
Voksen-fødte nevroner i luktelappen kan optogenetically styres ved hjelp Channelrhodopsin2-uttrykke lentiviral injeksjon i rostral vandrende bekken og kronisk photostimulation med en implantert miniatyr LED.
Abstract
Lokale interneurons kontinuerlig regenereres i luktelappen hos voksne gnagere 1-3. I denne prosessen kalles voksen neurogenesis, nevrale stamceller i veggene i den laterale ventrikkelen gi opphav til neuroblasts som vandrer for flere millimeter langs rostral vandrende stream (RMS) for å nå og innlemme i luktelappen. Å studere de ulike trinnene og virkningen av voksen-født neuron integrering i preexisting olfactory kretser, er det nødvendig å selektivt etiketten og manipulere aktiviteten av denne bestemte befolkning av nerveceller. Den siste tidens utvikling av optogenetic teknologier gir muligheten til å bruke lys til å nettopp aktivere denne spesifikke kohort av nerveceller uten å påvirke omkringliggende nerveceller 4,5. Her presenterer vi en rekke prosedyrer for å virally uttrykke Channelrhodopsin2 (ChR2)-YFP i en timelig begrenset kohort av neuroblasts i RMS før de når luktelappen og bli voksen-født neurons. I tillegg viser vi hvordan implantatet og kalibrere en miniatyr LED for kronisk in vivo stimulering av ChR2-uttrykke nevroner.
Protocol
Discussion
Optogenetic verktøy nylig har økt vår kontroll over selektiv nevronal befolkningen, inkludert voksen født nevroner i luktsystemet. Her beskriver vi hvordan du utfører en stereotaxic injeksjon av en lentiviral vektor uttrykker ChR2-YFP i en bestemt populasjon av voksen-fødte nevroner. Ved å nøye overvåke perioden etter injeksjon, er vi i stand til å analysere og manipulere aktiviteten til en kohort av voksen-fødte nevroner med en relativ homogen alder.
På grunn av deres lave diffu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av livsforsikringsselskap "Novalis-Taitbout", Ecole des Neurosciences de Paris (ENP), den Agence Nationale de la Recherche "ANR-09-NEUR-004" i rammen av "ERA-NET neuron" av FP7 program av Europakommisjonen, "Foundation pour la Recherche Medicale", den Letten Foundation og Pasteur Foundation.
Materials
| Material | Company | Catalogue No. |
| Ketamine | Merial | Imalgène 1000 |
| Xylazine | Bayer Health Care | Rompum 0.2% |
| Pipette Puller | Sutter | P-97 |
| Glass Capillaries (3.5″) | Drummond Scientific | 3-000-203-G/X |
| Nanoject II Microinjector | Drummond Scientific | 3-000-204 |
| High speed surgical drill | Fine Science Tools | 18000-17 |
| Micro Drill Steel Burrs 0.7mm tip diameter | Fine Science Tools | 19008-07 |
| LED CMS blue 4.6 W | OSRAM | LBW5SN |
| Female electrical connector (2.54 mm) | Fischer Elektronik | BL5.36Z |
| Current controller for LED (max: 1A) | A1W Electronik | HKO-KL50-1000 |
| Pulse generator | AMPI | Master-8 |
| Optical power meter | Thor Labs | PM100 |
| Cyanoacrylate adhesive | Loctite | 454 |
| Polycarboxylate cement (first layer cement) | Septodont | Selfast (#0068Q) |
| Methacrylate cement (second layer cement) | GC InternationalCorp. | Unifast Trad – Liquid (#339292) Unifast Trad – Powder (#339114) |
| Carprofen | Pfizer | Rimadyl |
References
- Lledo, P. M. Adult neurogenesis and functional plasticity in neuronal circuits. Nat. Rev. Neurosci. 7, 179-193 (2006).
- Alonso, M. Turning astrocytes from the rostral migratory stream into neurons: a role for the olfactory sensory organ. J. Neurosci. 28, 11089-11102 (2008).
- Mouret, A. Learning and survival of newly generated neurons: when time matters. J. Neurosci. 28, 11511-11516 (2008).
- Bardy, C. How, when, and where new inhibitory neurons release neurotransmitters in the adult olfactory bulb. J. Neurosci. 30, 17023-17034 (2010).
- Haubensak, W. Genetic dissection of an amygdala microcircuit that gates conditioned fear. Nature. 468, 270-276 (2010).
- Zhang, F. Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry. Nature. 446, 633-639 (2007).
- Wang, X., McManus, M. Lentivirus Production. J. Vis. Exp. (32), e1499-e1499 (2009).
- Cardin, J. A. Targeted optogenetic stimulation and recording of neurons in vivo using cell-type-specific expression of Channelrhodopsin-2. Nature protocols. 5, 247-254 (2010).
- Huber, D. Sparse optical microstimulation in barrel cortex drives learned behaviour in freely moving mice. Nature. 451, 61-64 (2010).
- Arenkiel, B. R. In vivo light-induced activation of neural circuitry in transgenic mice expressing channelrhodopsin-2. Neuron. 54, 205-218 .
- Albeanu, D. F. LED arrays as cost effective and efficient light sources for widefield microscopy. PLoS ONE. 3, 2146-2146 (2008).
- Slotnick, B., Bodyak, N. Odor Discrimination and Odor Quality Perception in Rats with Disruption of Connections between the Olfactory Epithelium and Olfactory Bulbs. J. Neurosci. 22, 4205-4216 (2002).
- Gradinaru, V. Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics. Cell. 141, 154-165 (2010).
- Valley, M., Wagner, S., Gallarda, B. W., Lledo, P. Using Affordable LED Arrays for Photo-Stimulation of Neurons. J. Vis. Exp. (57), e3379-e3379 (2011).
