Selektiv Viral nervsystemet av vuxna födda Olfactory Neuroner för kronisk In vivo Optogenetic Stimulering
Summary
Vuxna födda nervceller i luktloben kan optogenetically kontrolleras med Channelrhodopsin2-uttryckande Lentiviral injektion i rostralt flyttande strömmen och kronisk photostimulation med en inopererad miniatyr lysdiod.
Abstract
Lokala interneuronen ständigt återskapas i luktloben av vuxna gnagare 1-3. I denna process, som kallas vuxen neurogenes, neurala stamceller i väggarna i den laterala ventrikeln ger upphov till neuroblaster att migrera flera millimeter längs rostralt vandrande ström (RMS) för att nå och införliva luktbulben. För att studera de olika stegen och effekterna av vuxna födda neuron integration i redan existerande lukt kretsar, är det nödvändigt att selektivt märka och manipulera aktiviteten hos denna specifika populationen av nervceller. Den senaste tidens utveckling av optogenetic teknik ger möjlighet att använda ljus för att exakt aktivera denna specifika kohort av nervceller utan att påverka omgivande nervceller 4,5. Här presenterar vi en rad förfaranden för att viralt uttrycka Channelrhodopsin2 (ChR2)-YFP i en tidsmässigt begränsad kohort av neuroblaster i RMS innan de når luktbulben och bli vuxna födda neurons. Dessutom visar vi hur implantatet och kalibrera en miniatyr LED för kronisk in vivo stimulering av ChR2-uttryckande nervceller.
Protocol
Discussion
Optogenetic verktyg har nyligen ökat vår kontroll över selektiv neuronal befolkningar, inklusive vuxna född nervceller i luktsinne. Här beskriver vi hur du utför en stereotaxic injektion av en Lentiviral vektor som uttrycker ChR2-YFP i en viss population av vuxna födda nervceller. Genom att noggrant övervaka perioden efter injektion, kan vi analysera och manipulera aktiviteten hos en kohort av vuxna födda nervceller med en relativt homogen ålder.
Grund av deras låga spridning spri…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av livbolaget "Novalis-Taitbout", Ecole des Neurovetenskap de Paris (ENP), Agence Nationale de la Recherche "ANR-09-neur-004" inom ramen för "ERA-NET NEURON" av FP7-program från Europeiska kommissionen, "Stiftelsen pour la Recherche médicale", den Letten Foundation och Pasteur stiftelsen.
Materials
| Material | Company | Catalogue No. |
| Ketamine | Merial | Imalgène 1000 |
| Xylazine | Bayer Health Care | Rompum 0.2% |
| Pipette Puller | Sutter | P-97 |
| Glass Capillaries (3.5″) | Drummond Scientific | 3-000-203-G/X |
| Nanoject II Microinjector | Drummond Scientific | 3-000-204 |
| High speed surgical drill | Fine Science Tools | 18000-17 |
| Micro Drill Steel Burrs 0.7mm tip diameter | Fine Science Tools | 19008-07 |
| LED CMS blue 4.6 W | OSRAM | LBW5SN |
| Female electrical connector (2.54 mm) | Fischer Elektronik | BL5.36Z |
| Current controller for LED (max: 1A) | A1W Electronik | HKO-KL50-1000 |
| Pulse generator | AMPI | Master-8 |
| Optical power meter | Thor Labs | PM100 |
| Cyanoacrylate adhesive | Loctite | 454 |
| Polycarboxylate cement (first layer cement) | Septodont | Selfast (#0068Q) |
| Methacrylate cement (second layer cement) | GC InternationalCorp. | Unifast Trad – Liquid (#339292) Unifast Trad – Powder (#339114) |
| Carprofen | Pfizer | Rimadyl |
References
- Lledo, P. M. Adult neurogenesis and functional plasticity in neuronal circuits. Nat. Rev. Neurosci. 7, 179-193 (2006).
- Alonso, M. Turning astrocytes from the rostral migratory stream into neurons: a role for the olfactory sensory organ. J. Neurosci. 28, 11089-11102 (2008).
- Mouret, A. Learning and survival of newly generated neurons: when time matters. J. Neurosci. 28, 11511-11516 (2008).
- Bardy, C. How, when, and where new inhibitory neurons release neurotransmitters in the adult olfactory bulb. J. Neurosci. 30, 17023-17034 (2010).
- Haubensak, W. Genetic dissection of an amygdala microcircuit that gates conditioned fear. Nature. 468, 270-276 (2010).
- Zhang, F. Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry. Nature. 446, 633-639 (2007).
- Wang, X., McManus, M. Lentivirus Production. J. Vis. Exp. (32), e1499-e1499 (2009).
- Cardin, J. A. Targeted optogenetic stimulation and recording of neurons in vivo using cell-type-specific expression of Channelrhodopsin-2. Nature protocols. 5, 247-254 (2010).
- Huber, D. Sparse optical microstimulation in barrel cortex drives learned behaviour in freely moving mice. Nature. 451, 61-64 (2010).
- Arenkiel, B. R. In vivo light-induced activation of neural circuitry in transgenic mice expressing channelrhodopsin-2. Neuron. 54, 205-218 .
- Albeanu, D. F. LED arrays as cost effective and efficient light sources for widefield microscopy. PLoS ONE. 3, 2146-2146 (2008).
- Slotnick, B., Bodyak, N. Odor Discrimination and Odor Quality Perception in Rats with Disruption of Connections between the Olfactory Epithelium and Olfactory Bulbs. J. Neurosci. 22, 4205-4216 (2002).
- Gradinaru, V. Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics. Cell. 141, 154-165 (2010).
- Valley, M., Wagner, S., Gallarda, B. W., Lledo, P. Using Affordable LED Arrays for Photo-Stimulation of Neurons. J. Vis. Exp. (57), e3379-e3379 (2011).
