S'étendant de courtes séquences d'ADN avec Constant Brucelles force axiale optiques

Summary

Nous illustrons l'utilisation d'une constante de force axiale pinces optiques pour étudier les propriétés mécaniques des molécules d'ADN courts. En étirant l'ADN axialement, nous minimisons empêchements stériques et des artefacts liés à la manipulation latérale conventionnelle, ce qui nous permet d'étudier les molécules d'ADN plus court ~ 100 nm.

Abstract

Une seule molécule d'ADN techniques d'étirement des longueurs de contour moins d'un kilobases sont marquées par des difficultés expérimentales. Cependant, de nombreux événements intéressants biologiques tels que fixation sur les histones et les protéines médiée par boucle d'ADN ^1,2, se produisent sur ​​cette échelle de longueur. Ces dernières années, les propriétés mécaniques de l'ADN ont été montré à jouer un rôle important dans les processus cellulaires fondamentaux comme l'empaquetage de l'ADN dans les nucléosomes compacts et des fibres de chromatine ^3,4. De toute évidence, il est alors important de comprendre les propriétés mécaniques de courts tronçons de l'ADN. Dans cet article, nous proposons un guide pratique pour une technique simple molécule optique tweezing que nous avons développé pour étudier le comportement mécanique de l'ADN avec des longueurs de contour aussi courts que quelques centaines de paires de bases.

Le principal obstacle à étirer courts segments d'ADN, c'est que les pinces optiques classiques sont généralement conçus pour appliquer une force dans une direction latéral à l'étape ^5,6, (voir Fig. 1). Dans cette géométrie, l'angle entre le bourrelet et la lamelle couvre-objet, dans laquelle l'ADN est attaché, est très raide pour l'ADN de longueur inférieure au micron. La position axiale doivent maintenant être pris en compte, ce qui peut être un défi, et, depuis l'extension entraîne la microsphère près de la lamelle, effets stériques sont améliorées. En outre, en raison de l'asymétrie des microsphères, des extensions latérales génère différents niveaux de couple due à la rotation de la microsphère dans le piège optique depuis la direction de la force de réaction pendant les changements de l'extension.

D'autres méthodes de l'ADN submicronique étirement se heurtent à leurs propres obstacles uniques. Par exemple, un piège à double faisceau optique est limitée à l'étirement d'ADN d'environ une longueur d'onde, au cours de laquelle les effets d'interférence de points entre les deux pièges et de diffusion de la lumière entre les microsphères commence à poser un problème important. Remplacer l'un des piègesavec une micropipette serait très probablement souffrir de problèmes similaires. Si l'on peut utiliser directement le potentiel axiale d'étirer l'ADN, un schéma de rétroaction active serait nécessaire pour appliquer une force constante et la bande passante ce sera très limitée, en particulier à de faibles forces.

Nous contourner ces problèmes fondamentaux en tirant directement l'ADN loin de la lamelle à l'aide d'une force axiale constante de pinces optiques ^7,8. Ce résultat est obtenu en piégeant le bourrelet dans une zone linéaire du potentiel optique, lorsque la force est constante optique-dont la force peut être ajustée par réglage de la puissance du laser. Piégeage à l'intérieur de la région linéaire sert aussi de tout optique de force de serrage sur l'ADN qui s'étend depuis près de 350 nm dans la direction axiale. Nous simultanément compenser la dérive thermique et mécanique par le réglage fin de la position de la platine de telle sorte que d'une microsphère de référence collée sur la lamelle couvre-objet reste à la même position et orientation, unellowing pour une période d'observation pratiquement illimitées.

Protocol

1. Pince à épiler Setup Le faisceau d'un laser à 1064 nm est séparé en deux faisceaux polarisés orthogonalement. On est habitué à manipuler la biomolécule tandis que l'autre est utilisée à des fins d'étalonnage (voir Fig. 2). L'intensité du faisceau est commandée par la manipulation d'un déflecteur acousto-optique (OD), tandis que la position et l'orientation de chaque faisceau est commandé indépendamment par des miroirs d'orientation du faisceau et de t?…

Discussion

Pinces optiques classiques invoquer supporte rétroaction analogique ou commandé par ordinateur pour appliquer une force constante sur un objet réfringent. Ces systèmes de rétroaction actifs ont du mal à effectuer dans des conditions où des changements brusques de l'extension de l'échantillon se produire, par exemple, à partir de la liaison d'une protéine à l'ADN ou l'intensification rapide d'un moteur moléculaire le long d'un filament. Diverses méthodes passives d'application…

Materials

Reagent/Equipment	Company	Catalog number	Comments
Nd:YVO4 laser	Spectra Physics	T40-Z-106C
Acousto-optic deflector	IntraAction	DTD-274HA6
Microscope Objective	Olympus	PlanApo	60X, NA 1.4
Piezo stage	Mad City Labs	Nano-LP100	XYZ stage
CCD camera	PixeLink	PL-A741
Photodetector	Electro-Optics Tech	ET-3020
Polystyrene Beads	Spherotech	SVP-08-10	800nm, streptavidin coated
Anti-digoxigenin	Roche	11333089001	From sheep
Primers	MWG operon	Custom oligos	One primer: biotin Other : digoxigenin
PCR reagents	New England Biolabs	TAQ polymerase, dNTPs
Coverglass	Fisher Scientific
Other chemicals for buffer	Fisher Scientific

Supplementary Materials

A. Hydrodynamic Friction Coefficient

For determining the hydrodynamic friction coefficient of the microsphere near a surface one can use the following expansion^5,10:

where the following shorthand has been introduced:

The friction coefficient is defined in terms of the fluid viscosity η and the radius of the microsphere, with the microsphere’s center located a distance η above the surface. The summation converges reasonably well when expanded to about ten terms.

B. Influence of Axial Position on Stiffness Calibration

The calibration of the trap stiffness involves a tradeoff between the accuracy of the calibration, which increases with increasing distance from the surface, and the actual axial position where the trap is used experimentally. In general, the trap is calibrated at around 800-1000 nm from the surface, which is higher than the actual experimental condition.

C. Modified Worm-Like Chain (WLC) Model

The force extension curves can be fit to a modified WLC model that accounts for volume exclusion effects at zero optical force as follows:

where F_opt is the optical force, x_o is a fit parameter for the zero force extension,x_opt is the extension under force, l is the contour length of the DNA, and l*_p is a second fit parameter for an “effective” persistence length. F_wlc is given by the usual WLC model¹¹

where ε is the relative DNA extension.