コンスタント·フォース軸光ピンセットを用いたDNAの短い配列を伸ばす
Summary
我々は、短いDNA分子の機械的性質を探求する一定の力軸光ピンセットの使用を例証します。軸方向にDNAを延伸することによって、私たちは私たちが約100nm限り短くDNA分子を研究できるように、立体障害と、従来の横方向の操作で生じるアーチファクトを最小限に抑えることができます。
Abstract
小さいキロより輪郭の長さのDNAを延伸する単一分子技術は実験的困難をはらんでいます。しかし、このようなヒストン結合し、DNAの1,2タンパク質媒介ルーピングなど、多くの興味深い生物学的事象は、この長さスケールで発生します。近年では、DNAの機械的特性は、コンパクトなヌクレオソームとクロマチン繊維3,4へのDNAのパッケージングのような基本的な細胞プロセスにおいて重要な役割を果たすことが示されている。明らかに、それは、DNAの短いストレッチの機械的性質を理解することが次に重要です。本稿では、我々は数百塩基対程度の短い輪郭長を持つDNAの機械的挙動を研究するために開発した単一分子光tweezing技術に実用的なガイドを提供します。
DNAの短いセグメントをストレッチングの主なハードルは、従来の光ピンセットは、一般のdirectioに力を適用するために設計されていることであるnは5,6ステージに横方向（図1参照）。この幾何学では、DNAが繋がれているためビーズとカバーガラス、、の間の角度は、サブミクロンの長さのDNAのための非常に急峻になる。軸方向の位置は、現在拡張子がカバースリップに近い微小球をドラッグしているので、立体効果が強化され、挑戦することができ、これを占めており、されなければならない。さらに、微小球の非対称性の結果として、横方向の拡張は、拡張時の反力の変化の方向が光学トラップ内の微小球の回転によるトルクのさまざまなレベルを生成します。
ストレッチサブミクロンDNAのための代替方法は、独自のユニークなハードルにぶつかる。例えば、デュアルビーム光学トラップが2つのトラップの間に微小球の間の光の散乱点からの干渉の影響が重大な問題を提起するために開始する波長、周りのDNAを引き伸ばしに制限されています。トラップの1つを交換マイクロピペットで最も可能性が高い同様の課題に苦しむだろう。一つは直接DNAを伸ばすために軸方向のポテンシャルを使うこともできますが、アクティブ·フィードバック方式は一定の力を適用し、この帯域幅は、特に低力で、かなり限定されますが必要でしょう。
我々は、直接一定の力軸方向の光ピンセット7,8を使用してカバーグラスから離したDNAを引いて、これらの根本的な問題を回避する。これは、光力がある光学ポテンシャル、定レーザーパワーを調節することによって調整することができるの強さの線形領域でビーズを捕捉することによって達成される。線形領域内トラッピングも軸方向に約350 nmの拡張するDNA上のすべての光力クランプとして機能します。我々は同時に、細かくカバースリップにこだわった基準微小球が同じ位置とフォーカスのままであるように、ステージの位置を調整することにより、熱的、機械的なドリフトを補償実質的に無限の観察期間のためllowing。
Protocol
Discussion
従来の光ピンセットは、屈折物体に一定の力を適用するために、アナログまたはコンピューター制御のフィードバックに依存しています。これらのアクティブ·フィードバック·システムは、タンパク質の結合に由来するDNAまたはフィラメントに沿って分子モーターの急速なステッピングには、例えば、試料の延長の急激な変化が発生した条件の下で行うことが困難である。一定の力を加える…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は、軸方向の光ピンセットのヘルプについては、この原稿に彼のストレッチングデータの一部を寄付するための博士儀·ファンチェンに感謝します。この作品は、NSFの助成金、PHY-0957293とフォーカス助成PHY-0114336によって後援されています。
Materials
| Reagent/Equipment | Company | Catalog number | Comments |
|---|---|---|---|
| Nd:YVO4 laser | Spectra Physics | T40-Z-106C | |
| Acousto-optic deflector |
IntraAction | DTD-274HA6 | |
| Microscope Objective | Olympus | PlanApo | 60X, NA 1.4 |
| Piezo stage | Mad City Labs | Nano-LP100 | XYZ stage |
| CCD camera | PixeLink | PL-A741 | |
| Photodetector | Electro-Optics Tech |
ET-3020 | |
| Polystyrene Beads | Spherotech | SVP-08-10 | 800nm, streptavidin coated |
| Anti-digoxigenin | Roche | 11333089001 | From sheep |
| Primers | MWG operon | Custom oligos | One primer: biotin Other : digoxigenin |
| PCR reagents | New England Biolabs |
TAQ polymerase, dNTPs |
|
| Coverglass | Fisher Scientific | ||
| Other chemicals for buffer |
Fisher Scientific |
Supplementary Materials
A. Hydrodynamic Friction Coefficient
For determining the hydrodynamic friction coefficient of the microsphere near a surface one can use the following expansion5,10:
where the following shorthand has been introduced:
The friction coefficient is defined in terms of the fluid viscosity η and the radius of the microsphere, with the microsphere’s center located a distance η above the surface. The summation converges reasonably well when expanded to about ten terms.
B. Influence of Axial Position on Stiffness Calibration
The calibration of the trap stiffness involves a tradeoff between the accuracy of the calibration, which increases with increasing distance from the surface, and the actual axial position where the trap is used experimentally. In general, the trap is calibrated at around 800-1000 nm from the surface, which is higher than the actual experimental condition.
C. Modified Worm-Like Chain (WLC) Model
The force extension curves can be fit to a modified WLC model that accounts for volume exclusion effects at zero optical force as follows:
where Fopt is the optical force, xo is a fit parameter for the zero force extension,xopt is the extension under force, l is the contour length of the DNA, and l*p is a second fit parameter for an “effective” persistence length. Fwlc is given by the usual WLC model11
where ε is the relative DNA extension.
References
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