Transretinal записи ЭРГ от мыши Retina: палочек и колбочек Photoresponses

Summary

Мы описываем относительно простой метод transretinal электроретинограммы (ЭРГ) записи для получения палочек и колбочек photoresponses с нетронутой сетчатке мышей. Такой подход имеет преимущество блока синаптической передачи от фоторецепторов, чтобы изолировать их свет ответы и записать их с помощью поля электродов, расположенных по всей изолированные плоские установлен сетчатки.

Abstract

Есть два различных классов формирования изображения фоторецепторов в сетчатке глаза позвоночных: палочки и колбочки. Стержни способны обнаруживать одиночные фотоны света в то время как конусы непрерывно работать в быстро меняющихся условиях яркого света. Поглощение света стержень и конус конкретных зрительных пигментов в наружных сегментов фоторецепторов вызывает фототрансдукции каскад, что в конечном итоге приводит к закрытию циклических нуклеотидов закрытых каналов на мембране клетки и гиперполяризации. Это светоиндуцированного изменения мембранного тока и потенциал может быть зарегистрирован в качестве фотоотклика, либо классический ^1,2 электрод всасывания технику записи или записи transretinal электроретинограммы (ЭРГ) с изолированной сетчатки с фармакологически заблокирован постсинаптических компонентов ответ ^3-5. Последний метод позволяет наркотики доступны длительные записи с мышью фоторецепторов и особенно полезна для получения стабильных photoresponses птОМ скудны и хрупкими конусов мыши. В случае конусы, такие эксперименты могут быть выполнены как в темно-адаптированных условиях и после интенсивного освещения, который отбеливает практически все зрительного пигмента, чтобы следить за процессом восстановления конус фоточувствительность в темное адаптации ^6,7. В этом видео мы покажем, как выполнять стержень и M / L-конус управляемой transretinal записи с темно-адаптированных мыши сетчатки. Род записи будут осуществляться с использованием сетчатки дикого типа (C57BL / 6) мышах. Для простоты конус записи будут получены из генетически модифицированных стержень трансдуцина α-субъединицы нокаут (ta ^{- / -)} мышей, которые не имеют стержень сигнализации ^8.

Protocol

1. Изготовление электродов

1. Подготовка стеклянных электродов. Взвесьте 120 мг агара и смешайте его в 10 мл дистиллированной воды (конечная концентрация агара 1,2%). Растопить агар решение в ванну с горячей водой. Заполните стеклянные капилляры (мы используем инструменты Слово Presision TW100-4 капилляров со следующими размерами: длина = 100 мм, OD / ID = 1/0.75 мм, а внутренний объем = 44 мкл) с агар решения с использованием пластикового шприца. Укрепить агар при комнатной температуре в течение 10 мин. Таким образом, до ~ 200 капилляры могут быть заполнены (остальные агар смесь можно хранить при температуре -4 ° С и повторно использовать несколько раз).
2. Разрежьте пополам капилляров помощью алмазного ножа.
3. Замочите в результате стеклянных электродов в мышь решение электрода, по крайней мере 24 часов при температуре 4 ° C. Хранить электродов при температуре 4 ° C и использовать их на протяжении 3-4 месяцев.

2. Настройка эксперимента

1. Темно-адаптировать мышь ночь. Использование дикого типа (например, C57Bl / 6) мыши для стержневых управляемой transretinal записи и T α ^{- / -} мышей, лишенных стержня сигнализации ⁸ конус transretinal записей.
2. Подготовить 1 л перфузионного раствора, 100 мл электрод решение, и 20 мл инкубационного раствора (см. ниже) и фильтровать корыта перфузии решение Millipore 0,45 мкм и 0,22 мкм фильтр (опция).
3. Калибровка источника света (505 нм светодиодные и галогенные лампы оптических стимулятор) с помощью фотометра помещается в плоскости сетчатки. В случае светодиодный источник света, использовать оптический рассеиватель света для достижения единообразия.
4. Подготовка перфузии камеры для эксперимента (камера конструкции могут отличаться). Наша камера из 3 оргстекла мм, нижний из крышки небольшие пластиковые чашки Петри, а также имеет активный объем перфузии ~ 400 мкл (L = 25 мм, W = 8 мм, H ≈ 2 мм). Заполните нижний электрод пространстве камеры с электродами растворе, содержащем 2 мМ L-глутамата и 10 мМ BaCl ₂. Использование пластиковых труб и стеклянного капилляра, чтобы связь между решением в нижний электрод пространства (из пластика разъем трубы прикреплены к нижней палаты) и держатель электрода. Убедитесь, что нет пузырей в электроде, соединительные трубки, или держатель электрода (очистить решения с использованием пластикового шприца, если это необходимо).
5. Установите запись камеры на сцене микроскопа (опционально: микроскоп может быть установлен на антивибрационные стол и экранированные в клетку Фарадея, чтобы минимизировать механические и электромагнитные помехи). Подключите нижний держатель электрода к положительному полюсу headstage дифференциального усилителя (например, Warner инструменты DP-311 усилитель). Центр и выравнивания камеры нижнего электрода с открытием месте световой раздражитель. Подключите перфузии линии записи камеры и поверните перфузии на.
6. Bubble перфузии раствора с 95% O _2/5% CO ₂ при инкубации его в 40 ° C Ватэ ванну. CO ₂ регулирует рН раствора до 7,2. Решение вытекает из бутылки, чтобы записи камеры под действием силы тяжести, проходящих через керамический резистор нагревательных его 36-37 ° C. Для уменьшения потерь тепла, нагревателем должна быть расположена как можно ближе к записи камеры возможно, в идеале на стадии микроскоп.
7. С регулятором потока регулировать расход около 1 мл / мин.
8. Подключите верхний электрод на второй (отрицательный) полюс headstage помощью второй держатель электрода. Привязка термопарой к верхнему электроду использованием уплотнительного кольца. Убедитесь, что электрод и термопары советы близко друг к другу так, чтобы температура чтении приняты как можно ближе к центру сетчатки, насколько это возможно. Погрузите кончик верхнего электрода в перфузии раствором и поместите его в центре камеры. Позвольте 10-15 минут для базовой стабилизации.
9. Регулировка напряжения постоянного тока на нагреватель, чтобы температура раствора составляет 36 -37 ° C.

3. Выделение мышью Retina

1. Под тусклым красным светом, усыпить темно-адаптированных мышь с CO ₂ и шейки дислокации. Дополнительно: сделать отметку на каждой мыши глазное яблоко от прижигания наиболее спинной точки склеры с прижиганием ручкой или с подогревом вскрытия PIN-код. Все последующие процедуры проводятся в инфракрасном свете с помощью инфракрасной преобразователи изображения подходят для рассечения микроскопом.
2. Проанализируйте из глаза с изогнутыми ножницами, слегка надавливая и растяжения кожи по бокам каждого глаза. Hemisect оба глаза при использовании инфракрасной подсветки microscissors или лезвием бритвы.
3. Удалить роговицы и хрусталика. Удалить столько стекловидного тела, как это возможно.
4. Пил первый сетчатки из слоя пигментного эпителия и, при необходимости, тщательно очистите его с помощью щипцов для удаления оставшихся гранул пигментного эпителия. Мы, как правило, используя всю сетчатку для палочек и колбочек transretИнал записей. Однако, если вы хотите записать в частности из спинной части сетчатки мышей, которая имеет больше M / L-конуса ⁹ до пилинга сетчатки удаление вентральной части наглазник с лезвия бритвы или microscissors помощью прижигания знак в качестве ссылки.
5. Поместите второй hemisected глазное яблоко в небольшом чашку Петри с инкубационный раствор и инкубировать препарата в светонепроницаемый ящик насыщенной чистым кислородом до использования. Как правило, в этих условиях второй наглазник мыши могут храниться в течение нескольких часов при комнатной температуре и использовать для записи.
6. С помощью стеклянной или пластиковой пипетки передачи изолированной сетчатки к снижению перфузии раствора (около 300 мл) на крышке чашки Петри. Добавить 5-6 капельки электродов раствор, содержащий BaCl ₂ предварительно инкубировать сетчатки с BaCl _2. Поместите квадратный кусок (около 5х5 мм) задней стороне угла смазкой (мы используем Dow Corning 111 смазку клапанов и герметик) Millipore фильтровальную бумагу (0,45 мкм HARG типа) с готовых дыру в центре (2-2,5 мм в диаметре), к тому же капля раствора. Используя щипцы положение сетчатки в верхней части фильтровальной бумаги (фоторецепторов стороной вверх) и нажмите ее края на периферии плоской смонтировать его. Сетчатки должна быть сосредоточена на открытии в фильтровальную бумагу.
7. Используя щипцы передать фильтровальную бумагу с сетчатки перфузии камеру и поместите его над стимул место краю нижнего электрода пространства. Слегка нажмите на смазанные края фильтровальной бумаги для соединения его с камеры.
8. Установите верхний электрод в центре сетчатки глаза (слегка касаться фоторецептора слой). Центрирование верхнего электрода на сетчатке увеличивается амплитуда сигнала (до ~ 20-40% по сравнению с помещая его ближе к краю сетчатки). Хотя такое расположение электродов слегка искажает эффективную интенсивность светового раздражителя достижения небольшой участок сетчатки (~ 12-15% от общей площади), до сих пор оптимальный способ размещения электроноврастоптал. Препарат готов к transretinal записей.

4. Transretinal Recordings

1. В зависимости от вашей линии мышей, запись стержень или M / L-конус управляемой ответы тест вспышки от тусклый к яркому интенсивность калиброванный света 505 нм, выделяемых из светодиодных источников света или оптический стимулятора. В случае наших светодиодных источников света, интенсивность вспышки контролируется путем сочетания компьютерное управление светодиодной входного напряжения, переключаемых резисторов, и набор фильтры нейтральной плотности (мы используем E-Цвет # 211 0.9 ND фильм фильтры Rosco лабораторий ), помещенный между светодиодами и сетчатки. Продолжительность светодиодной вспышкой тест (20 мс) контролируется с помощью компьютера. При использовании галогенной лампы оптических стимулятор, тест интенсивность вспышки и длины волны можно управлять с помощью набора фильтры нейтральной плотности и узкие фильтры интерференционных полос, соответственно. Испытание длительность вспышки можно управлять с помощью управляемого компьютером ставни.
2. Дополнительно: для поддержания эффективнойПодавление глиальных компонент фотоотклика с BaCl ₂ в течение дня, изменить нижний электрод решения иногда (например, до тестирования каждого сетчатки) очищая его с помощью пластиковых шприц, заполненный свежим раствором.

5. Представитель Результаты

Решения

1. Мышь сетчатки перфузии решение: 112,5 мм NaCl, 3,6 мМ KCl, 2,4 мМ MgCl _2, 1,2 мМ CaCl _2, 10 мМ HEPES (рН 7,2), 20 мМ NaHCO _3, 3 мМ сукцината натрия, 0,5 мМ Na глутамата, 0,02 мМ ЭДТА, и 10 мМ глюкозы. Кроме того, решение с добавлением 2 мМ L-глутамата и 10 мкМ DL-АР-4, чтобы блокировать более высокого порядка компонентов фотоотклика ^10,11 и 0,1% MEM витаминов и аминокислот MEM решения кислоты (Sigma), чтобы улучшить сетчатки жизнеспособность.
2. Мышь электрод решение: 140 мм NaCl, 3,6 мМ KCl, 2,4 мМ MgCl _2, 1,2 мМ CaCl _2, 3 мМ HEPES (рН 7,4, NaOH). Решение в нижней элементыctrode пространство также содержит 2 мМ L-глутамата, чтобы заблокировать синаптической передачи ¹⁰ и, кроме того, 10 мМ BaCl ₂ для подавления глиальных компонент фотоотклика ^3,12.
3. Решение Retina инкубации: растворить 272 мг L-15 среднего (Sigma) и 20 мг BSA в 20 мл дистиллированной воды. Окончательный L-15 и BSA концентрации 13,6 мг / мл и 1 мг / мл, соответственно. Отрегулируйте рН до 7,4 с 1 M HCl.

Рисунок 1. Принципиальная схема показывает выделение мышью сетчатки для transretinal записи ЭРГ.

Рисунок 2. Фотография камеры перфузии и записи электродов с их владельцами. Красные стрелки указывают направление потока перфузии.

Рисунок 3. Схема экспериментальной установки для transretinal записи ЭРГ. Красные стрелки указывают направление потока перфузии.

Результаты Рисунок 4 представителя. Записали семью мышь стержень управляемой transretinal ответов. Photoresponses были нижних частот фильтром на 30 Гц (8-контактный Бесселя), оцифрованные с частотой 1 кГц и хранятся на компьютере для дальнейшего анализа. Показано следы представляют собой средние 5-6 ответов на тусклый свет и интенсивность 2-3 ответов на интенсивности насыщения светом.

Рисунок 5 Представитель результаты. Записанных семью мышь конус управляемой transretinal ответов. Photoresponses были нижних частот фильтром на 30 Гц (8-контактный Бесселя), оцифрованные с частотой 1 кГц и хранятся на компьютере для дальнейшего анализа. Показано следы усреднениях годов 5-10 ответов на тусклый свет и интенсивность 3-5 ответов на интенсивности насыщения светом.

Discussion

Метод стержня и конус управляемой transretinal записи ЭРГ описанных выше становится мощным инструментом для исследования функции мыши фоторецепторы как дикого типа и генетически модифицированных животных. В дополнение к легкой характеристика основных свойств фотоотклика, этот простой метод обеспечивает большую стабильность ответ в течение длительных экспериментов на близкие к нетронутым препаратов сетчатки. И темно-адаптированных стержень максимальная амплитуда реакции и фотосенсибилизация в мышей дикого типа стабильны в течение по крайней мере, 1 час от начала записи, и темно-адаптированных конус максимальной амплитудой и светочувствительность, как правило, не снижаться более чем на 10% через 30-40 мин записей. Другие преимущества этого метода является его ответственность легкой фармакологических манипуляций, недоступен в классическом одноклеточные всасывания записи с мышью фоторецепторов, а также отсутствие анестезии, необходимой для выполнения живого животного ERG рекордINGS. Использование сетчатки Tα ^{- / -} мышей линии с устранена стержня сигнализации ⁸ конус записи transretinal существенно облегчает и экспериментальных процедур и интерпретации результатов. Это особенно важно в экспериментах, направленных на мониторинг мыши конус визуального восстановление пигмента после воздействия яркого освещения и / или учебы конусу функции при наличии устойчивого светлом фоне. Таким образом, новые захватывающие перспективы открываются для исследования физиологических свойств мыши палочки и колбочки в том числе модели мыши для стержневых и конус связанных визуальные расстройства.