Pull-down van calmoduline-bindende eiwitten

Summary

Calmoduline (CAM) pull-down test is een effectieve manier om de interactie van CaM te onderzoeken met verschillende eiwitten. Deze methode maakt gebruik van CAM-sepharose kralen voor een efficiënte en specifieke analyse van de CAM-bindende eiwitten. Dit levert een belangrijk instrument om CaM signalering verkennen in cellulaire functie.

Abstract

Calcium (Ca ^{2 +)} is een ion van vitaal belang bij het ​​reguleren van cellulaire functie door een verscheidenheid van mechanismen. Een groot deel van Ca ^{2 +} signalering wordt gemedieerd door de calcium-bindende eiwit bekend als calmodulin (CAM) ^1,2. CaM is betrokken op verschillende niveaus in bijna alle cellulaire processen, met inbegrip van apoptose, metabolisme, gladde spiercontractie, synaptische plasticiteit, zenuwgroei, ontsteking en de immuunrespons. Een aantal van de eiwitten helpen reguleren deze routes door hun interactie met Cam. Veel van deze interacties zijn afhankelijk van de conformatie van CAM, dat is duidelijk anders wanneer gebonden aan Ca ^{2 +} (Ca ^{2 +-CAM)} in tegenstelling tot de Ca ^{2 +-vrije} staat (ApoCaM) ^3.

Terwijl de meeste doelwit eiwitten binden Ca ^{2 +-CAM,} bepaalde eiwitten binden aan ApoCaM. Sommige binden CaM door middel van hun IQ-domein, met inbegrip neuromodulin ^4, neurogranin (Ng) ^5, en bepaalde myosins <sup> 6. Deze eiwitten is aangetoond dat ze een belangrijke rol in presynaptische functie ^7, postsynaptische functie ^8, en samentrekken van de spieren ⁹ te spelen, respectievelijk. Hun vermogen om te binden en laat CaM in de afwezigheid of aanwezigheid van Ca ^{2 +} staat centraal in hun functie. In tegenstelling tot vele eiwitten binden Ca ^{2 +-CaM} en vereisen deze binding voor hun activering. Voorbeelden hiervan zijn myosine lichte keten kinase ^10, Ca ^{2 +} / CAM-afhankelijke kinasen (CaMKs) ¹¹ en fosfatasen (bijv. calcineurine) ^12, en spectrin kinase ^13, die een verscheidenheid van directe en downstream effecten ¹⁴ hebben.

De effecten van deze eiwitten op cellulaire functie zijn vaak afhankelijk van hun vermogen om te CaM te binden in een Ca ^{2 +-afhankelijke} manier. Bijvoorbeeld, testten we de relevantie van Ng-CaM verbindend in synaptische functie en hoe de verschillende mutaties deze binding beïnvloeden. We genereerden een GFP-gelabelde Ng construct met specifieke mutaties in het IQ-domein dat het vermogen van Ng om CaM te binden in een Ca ^{2 +-afhankelijke} manier zou veranderen. De studie van deze verschillende mutaties gaf ons veel inzicht in belangrijke processen die betrokken zijn bij synaptische functie ^8,15. Echter, in deze studies, is het essentieel om aan te tonen dat de gemuteerde eiwitten de verwachte gewijzigde binding aan CaM hebben.

Hier presenteren we een methode voor het testen van het vermogen van proteïnen om naar CaM te binden in de aanwezigheid of afwezigheid van Ca ^{2 +,} met behulp van CaMKII en Ng als voorbeelden. Deze methode is een vorm van affiniteitschromatografie aangeduid als een CAM pull-down test. Het maakt gebruik van CAM-Sepharose kralen om te testen eiwitten die zich binden aan CaM en de invloed van Ca ^{2 +} op deze bindend. Het is aanzienlijk meer tijd efficiënter en vereist minder eiwit ten opzichte van kolomchromatografie en andere testen. Alles bij elkaar levert dit een waardevol instrument is om Ca ^{2 +} verkennen / CAM-signalering en eiwitten die interact met CAM.

Protocol

Zie figuur 1 voor een basis-schema van de procedure te beginnen met de homogenaat. Geschatte tijd vanaf de voorbereiding van de cellulaire extracten om elutie van CAM-gebonden eiwitten is ongeveer zes tot zeven uur. 1. Tissue voorbereiding Injecteer organotypische hippocampale plakken met een virus met een plasmide dat het recombinante eiwit van belang (in dit voorbeeld, groen fluorescerend eiwit (GFP)-gelabeld Ng) en laat een nacht weefsel te drukken eiwit. Ongeveer 12 …

Discussion

De verstrekte protocol maakt gebruik van CaM-sepharose kralen te onderzoeken van de Ca ^{2 +-afhankelijkheid} van de CAM-bindende eiwitten. Veel eiwitten binden CaM in een Ca ^{2 +-afhankelijke} manier. Deze interacties zijn van groot belang gezien het aantal van de Cam-bindende eiwitten en hun kritische rol in vele signaleringsroutes. In dit protocol zijn CaM-sepharose kralen gebruikt voor het CAM-bindende eiwitten te scheiden van weefsel homogenaat in de aanwezigheid of afwezigheid van Ca ^{2 +.</su…}

Materials

Product	Company	Catalogue number	Notes
Calmodulin-Sepharose beads	GE Healthcare	17-0529-01
Anti-CamKII alpha	Sigma-Aldrich	C6974
Anti-neurogranin	Millipore	07-425
Gel Loading Pipet Tips	Fisher	02-707-138	Use for aspiration of supernatants
Microcentrifuge tubes (2.0 mL)	Fisher	05-408-146	Use for all steps involving calmodulin-sepharose beads