Desplegable de proteínas de unión a calmodulina

Summary

Calmodulina (CaM) pull-down de ensayo es una forma efectiva para investigar la interacción de la CAM con varias proteínas. Este método utiliza CAM-sepharose bolas para el análisis eficiente y específica de la CAM-proteínas de unión. Esta es una importante herramienta para explorar la señalización CAM en la función celular.

Abstract

Calcio (Ca ^{2 +)} es un ion fundamental en la regulación de la función celular a través de una variedad de mecanismos. Gran parte de Ca ^{2 +} señalización está mediada por la proteína de unión a calcio se conoce como la calmodulina (CaM) ^1,2. CAM está involucrado en múltiples niveles en casi todos los procesos celulares, incluyendo la apoptosis, el metabolismo, la contracción del músculo liso, la plasticidad sináptica, el crecimiento del nervio, la inflamación y la respuesta inmune. Una serie de proteínas ayudan a regular estas vías a través de su interacción con la CAM. Muchas de estas interacciones dependen de la conformación del CAM, que es muy diferente cuando se une a Ca ^{2 +} (Ca ^{2 +-CaM)} en oposición a su Ca ^{2 +-estado} libre (ApoCaM) ^3.

Aunque la mayoría de las proteínas diana se unen Ca ^{2 +-CAM,} sólo ciertas proteínas se unen a ApoCaM. Algunos CAM se unen a través de su coeficiente intelectual es de dominio, incluyendo neuromodulin ^4, neurogranina (Ng) ^5, y algunas miosinas <sup> 6. Estas proteínas se ha demostrado que juegan un papel importante en la función presináptica ^7, la función postsináptica ^{8, 9} y la contracción muscular, respectivamente. Su capacidad para unirse y liberación de CAM en la ausencia o presencia de Ca ^{2 +} es fundamental en su función. Por el contrario, muchas proteínas sólo se unen Ca ^{2 +-CAM} y requieren este enlace para su activación. Los ejemplos incluyen la cinasa de la cadena ligera de miosina ^10, Ca ^{2 +} / CaM-quinasas dependientes (CaMK) ¹¹ y fosfatasas (por ejemplo, la calcineurina) ^12, y espectrina quinasa ^13, que tienen una variedad de efectos directos y aguas abajo ^14.

Los efectos de estas proteínas en la función celular a menudo dependen de su capacidad para unirse a la CAM en una Ca ^{2 +-dependiente.} Por ejemplo, hemos probado la relevancia de Ng-CAM vinculante en la función sináptica y cómo las diferentes mutaciones afectan a esta unión. Hemos generado una estafa GFP-etiquetados Ngestructura con mutaciones específicas en el CI en el dominio que iba a cambiar la capacidad de Ng a unirse una webcam en una Ca ^{2 +-dependiente.} El estudio de estas mutaciones diferentes nos dio una gran comprensión de los procesos importantes que intervienen en la función sináptica ^8,15. Sin embargo, en estos estudios, es esencial para demostrar que las proteínas mutadas se espera que la unión a CaM alterado.

A continuación, presentamos un método para probar la capacidad de las proteínas que se unen a CAM en la presencia o ausencia de Ca ^{2 +,} con CaMKII y Ng como ejemplos. Este método es una forma de cromatografía de afinidad a que se refiere como una cámara desplegable ensayo. Utiliza CAM-Sepharosa cuentas para poner a prueba las proteínas que se unen a la leva y la influencia de Ca ^{2 +} en este enlace. Es un tiempo considerablemente más eficiente y requiere menos proteína en relación con la cromatografía de columna y otros ensayos. En conjunto, esto proporciona una valiosa herramienta para explorar Ca ^{2 +} / CAM y señalización de las proteínas que, encontrarrestar con la CAM.

Protocol

Refiérase a la Figura 1 para un esquema básico de principios procedimiento con el homogeneizado. Tiempo estimado de preparación de extractos celulares de elución de la CAM con destino proteínas es de aproximadamente seis a siete horas. 1. Preparación de tejidos Inyectar organotípicos rodajas de hipocampo con un virus que contiene un plásmido que expresa la proteína recombinante de interés (en este ejemplo, la proteína verde fluorescente (GFP)-etiquetados Ng) y permitir …

Discussion

El protocolo al que se utiliza CAM-sepharose bolas para investigar la Ca ^{2 +-dependencia} de la CAM-proteínas de unión. Muchas proteínas se unen una webcam en una Ca ^{2 +-dependiente.} Estas interacciones son de gran importancia dada la cantidad de proteínas de unión a CaM y su papel fundamental en muchas vías de señalización. En este protocolo, la CAM-sepharose bolas se utilizan para separar la CaM proteínas de unión a partir de tejido homogeneizado en la presencia o ausencia de Ca ^{2 +…}

Materials

Product	Company	Catalogue number	Notes
Calmodulin-Sepharose beads	GE Healthcare	17-0529-01
Anti-CamKII alpha	Sigma-Aldrich	C6974
Anti-neurogranin	Millipore	07-425
Gel Loading Pipet Tips	Fisher	02-707-138	Use for aspiration of supernatants
Microcentrifuge tubes (2.0 mL)	Fisher	05-408-146	Use for all steps involving calmodulin-sepharose beads