Pull-down di Calmodulina proteine ​​leganti

Summary

Calmodulina (CaM) pull-down saggio è un modo efficace per studiare l'interazione del CAM con varie proteine. Questo metodo utilizza CaM-sefarosio perle per l'analisi efficiente e specifica di CaM proteine ​​leganti. Questo fornisce un importante strumento per esplorare segnalazione CaM in funzione cellulare.

Abstract

Calcio (Ca ^{2 +)} è uno ione fondamentale nella regolazione della funzione cellulare attraverso una varietà di meccanismi. Gran parte del Ca ^{2 +} segnalazione è mediato attraverso la proteina legante il calcio conosciuto come calmodulina (CaM) ^1,2. CaM è coinvolta a più livelli in quasi tutti i processi cellulari, tra cui l'apoptosi, il metabolismo, la contrazione della muscolatura liscia, la plasticità sinaptica, la crescita dei nervi, l'infiammazione e la risposta immunitaria. Un certo numero di proteine ​​aiutano a regolare queste vie attraverso la loro interazione con la CaM. Molte di queste interazioni dipende dalla conformazione della CAM, che è nettamente diverso quando si lega al Ca ^{2 +} (Ca ^{2 +-Cam),} in opposizione alla sua Ca ^{2 +} libero stato (ApoCaM) ^3.

Mentre la maggior parte delle proteine ​​bersaglio legano Ca ^{2 +-CAM,} solo alcune proteine ​​si legano ai ApoCaM. Alcuni CaM si legano attraverso il loro IQ-dominio, tra cui neuromodulin ^4, neurogranin (Ng) ^5, e alcuni miosine <sup> 6. Queste proteine ​​hanno dimostrato di giocare un ruolo importante nella funzione presinaptica ^7, funzione post-sinaptici ^8, e la contrazione muscolare ^9, rispettivamente. La loro capacità di legare e rilasciare CaM in assenza o in presenza di Ca ^{2 +} è fondamentale nella loro funzione. Al contrario, molte proteine ​​si legano solo Ca ^{2 +-CAM} e necessitano di questo legame per la loro attivazione. Gli esempi includono miosina chinasi della catena leggera ^10, Ca ^{2 +} / CaM chinasi-dipendenti (CaMKs) ¹¹ e fosfatasi (ad esempio calcineurina) ^12, e spettrina chinasi ^13, che hanno una varietà di effetti diretti ed a valle ^14.

Gli effetti di queste proteine ​​sulla funzione cellulare dipendono spesso dalla loro capacità di legarsi al CaM in Ca ^{2 +-dipendente.} Per esempio, abbiamo testato la rilevanza di Ng-CAM obbligatorio in funzione sinaptica e di come diverse mutazioni influenzano questa associazione. Abbiamo generato un GFP-tagged con Ngstruct con mutazioni specifiche nel IQ-dominio che avrebbe cambiato la capacità di Ng di legare CaM in Ca ^{2 +-dipendente.} Lo studio di queste mutazioni diverse ci ha dato grande intuizione in importanti processi coinvolti nella funzione sinaptica ^8,15. Tuttavia, in tali studi, è essenziale per dimostrare che le proteine ​​mutate hanno atteso il legame alterato per CAM.

Qui vi presentiamo un metodo per testare la capacità delle proteine ​​di legarsi al CaM in presenza o in assenza di Ca ^{2 +,} con CaMKII e Ng come esempi. Questo metodo è una forma di cromatografia di affinità indicato come un pull-down assay CaM. Utilizza CaM-Sepharose perline per testare le proteine ​​che si legano CaM e l'influenza di Ca ^{2 +} su questa associazione. E 'molto più tempo efficiente e richiede meno proteine ​​rispetto alla cromatografia su colonna, ed altri test. Complessivamente, questo fornisce un valido strumento per esplorare Ca ^{2 +} / CaM e proteine ​​di segnalazione che interact con CaM.

Protocol

Fare riferimento alla Figura 1 per uno schema di base della procedura a partire con l'omogeneizzato. Tempo stimato dalla preparazione di estratti cellulari a eluizione di Cam-bound proteine ​​è di circa 6-7 ore. 1. Preparazione del tessuto Iniettare organotipica fettine di ippocampo con un virus che contiene un plasmide che esprime la proteina ricombinante di interesse (in questo esempio, proteina fluorescente verde (GFP)-tagged Ng) e permettono di esprimere la proteina d…

Discussion

Il protocollo fornito utilizza CaM-sefarosio perline per indagare il Ca ^{2 +-dipendenza} di CaM proteine ​​leganti. Molte proteine ​​si legano CaM in Ca ^{2 +-dipendente.} Queste interazioni sono di grande importanza dato il numero di proteine ​​che legano CaM e il loro ruolo fondamentale in molte vie di segnalazione. In questo protocollo, Cam-sefarosio perline vengono utilizzate per separare CaM-binding proteins da tessuto omogenato in presenza o in assenza di Ca ^{2 +.} I risultati…

Materials

Product	Company	Catalogue number	Notes
Calmodulin-Sepharose beads	GE Healthcare	17-0529-01
Anti-CamKII alpha	Sigma-Aldrich	C6974
Anti-neurogranin	Millipore	07-425
Gel Loading Pipet Tips	Fisher	02-707-138	Use for aspiration of supernatants
Microcentrifuge tubes (2.0 mL)	Fisher	05-408-146	Use for all steps involving calmodulin-sepharose beads