Summary
Zebra balığı embriyonik kalp immün yapmak için hızlı bir şekilde açıklanmıştır. Tüm montaj immün yaklaşımı ile karşılaştırıldığında, bu yöntem, çok daha az işlem süresi içinde kalp hücre / hücre içi yapıları ortaya yüksek çözünürlüklü görüntüleri elde sağlayan antikorlar, penetrasyon önemli ölçüde artırır.
Abstract
Zebra balığı embriyo kalp gelişimi ve avantajlı embriyoloji ve genetik 1,2 nedeniyle insan kalp hastalıkları eğitimi için in vivo omurgalı modeli popüler bir hale gelir. Hakkında 100-200 embriyolar tek bir yetişkin balık çifti her hafta hazır. Eski utero geliştiren şeffaf embriyolar kalp kusurları 3 değerlendirmek için ideal. Herhangi bir gen ifadesi morfolino teknoloji veya RNA enjeksiyon 4 üzerinden manipüle edilebilir . Ayrıca, ileri genetik ekranlar zaten cardiogenesis 5 farklı bakış açılarını etkileyen mutant bir liste yarattı.
Tüm montaj immün bu hayvan modelinde belli bir doku 6 hedeflenen protein ifade desenini ortaya çıkarmak için önemli bir tekniktir. Ancak, hücre içi veya hücre yapıları ortaya çıkarabilir yüksek çözünürlüklü görüntüleri, özellikle fiziksel locat nedeniyle olarak zor olmuşturkalp ve antikorların zayıf penetrasyon iyon.
Burada, ilk kalp diseksiyon ve sonra bir mikroskop lamı yüzey boyama işlemi yapan bu darboğazları gidermek için bir yöntem sunar. Küçük kalp örneklerinin kaybını önlemek için ve çözüm kullanımını kolaylaştırmak için, bir immEdge kalem ile çizilmiş mikroskop slaytlar yüzey üzerinde bir daire içinde kalp örnekleri kısıtlı. Boyama sonra, floresan sinyalleri doğrudan bir bileşik mikroskop ile gözlemlenebilir.
Embriyonik bir balık kalp sadece birkaç hücre tabakalarından oluşan antikorları için yeni bir yöntem, penetrasyon önemli ölçüde artırır. Sağlam kalpleri yüksek kaliteli görüntüler gün 2 gün 6 yaş Zebra balığı embriyolarının için çok daha alayı süre içinde elde edilebilir. Bizim metodumuz, potansiyel olarak diğer organlara ya da Zebra balığı veya diğer küçük hayvanlar disseke leke uzatılabilir.
Protocol
1. Slayt hazırlanması ve nemlendirilmiş odasına
- Nemlendirilmiş odası boşaltılmış bir ucu kutusu gibi bir kutu yapılabilir. Odası ve örnekleri ışıktan korumak için alüminyum folyo ile kapağı sarın.
- Odanın içinde, kalbinde örnekleri kurumasını önlemek odanın içinde nem, korumak için bir yığın ıslak kağıt havlu koyun. Slaytlar için bir raf olarak kağıt havlu üstüne küçük bir mikroplak ayarlayın.
- Kalp 5x5 mm boyutunda numuneler için kuyu immEdge kalem kullanarak bir mikroskop lamı yüzeyinde ya çizgiler veya daire çizin. Slaytları kurumasını bekleyin.
- Nemlendirilmiş odasında slaytlar koyun ve her iyi 50ul taze% 4 formaldehit ekleyin.
2. Embriyonik kalp diseksiyonu
- Balık balık durdurmak vücut hareketleri kadar yaklaşık 1 dakika boyunca% 0.4 tricaine içeren E3 yumurta su 7 embriyo anestezisi ama yine de normal kalpdayak.
- Diseksiyon mikroskobu sahnede içbükey bir mikroskop lamı koyun. Concaved iyi embriyolar transfer.
- Kalp açıkça ortaya çıkarmak için diseksiyon mikroskop ışık kombinasyonu ayarlayın. Kişisel tercihinize bağlı olarak, bu karanlık alan veya DIC gibi polarize ışık durumu olabilir.
- Sonra kuru, iki insülin şırıngaları% 75 etanol ile temizleyin.
- Diseksiyon mikroskobu, kalp yüksek büyütme ve odak ayarlayın. Fiziksel kafasına yakın yumurta sarısı-hücre gruplarının sınır içine bir iğne ucu takarak bir embriyo düzeltin. Başka bir iğne yakın kalp bölgeye yerleştirin ve hızlı bir şekilde kalp çekin. Kalp embriyo tamamen ayrılmış değildir, kalp ve yumurta sarısı arasında kalan bağlı doku kesti.
- Mikroskop ayrılan kalp düşük büyütme ve odak ayarlayın. 10μl pipetteman kullanın ve 1μl hacim olarak ayarlayın. Çizin veya dokunmatik pipetteman ucu uygulaizole kalp içinde veya ucu yüzeye bağlı ya olacak, böylece kalp örnek.
- % 4 formaldehit hazırlanan slaytlar pipet ucu batırın ve çözüm kalp serbest pipetle piston bastırın. Su yüzey gerginliği de pipet çözüm kalp serbest bırakmak için yardımcı olur. Her kuyuda 3 kalpleri daha az koyun.
3. Immün
- Odasına kapatın ve yumuşak bir sallanan hareketi ile bir çalkalayıcı üzerine koydu. Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca kalp örnek sabitleyin.
- Slaytların arka su damlacıklarını ve tampon alışverişi için bir diseksiyon mikroskobu aşamasında slayt koymak.
- Her bir kuyunun boş bir bölgeye, bir 10μl pipetteman ucu batırın ve kalp örneklerinden ucu mümkün olduğunca tutmak. Çözüm ucu içine çekilir kalpleri su akışı ile hareket edebilir, ucuna takılı kalp önlemek için tedbirleri almak. DeğiştirmekGerekirse ucu yerelleştirme.
- Çözüm bir doku üzerine atın ve kalp örnek hava kabarcıklarının varlığı kolayca kayıp olduğundan uç kabarcıkları üreten kaçının. Kalp örnekleri kısa bir süre için kısmen kuru tutulması, kalpleri slaytlar bağlı kalmanıza yardımcı olabilir.
- Kalp örnek kapak ve 5 dakika boyunca yavaş bir sallanan hareketi nemlendirilmiş odasında inkübe 50μl PBST ekleyin. Durulama bir kez daha tekrarlayın. Bu adımdan sonra, kalp örnekleri nemlendirilmiş, 4 oda 1 haftaya kadar ° C saklanabilir
- PBST oda sıcaklığında 1 saat süreyle% 10 oranında koyun serumu ile kalp örnek engelleyin.
- Β-katenin antikor 1:200 seyreltme ve mef2 spesifik antikor 1:200 seyreltme gibi birincil antikorlar, kalp örnek inkübe, oda sıcaklığında 1 saat süreyle% 10 oranında koyun serumu / PBST.
- Oda sıcaklığında PBST üç defa (5 dk. Her biri) ile kalp örnek yıkayın.
- Ikincil örnek inkübePBST 0.5 saat alexa-etiketli anti-fare ve / veya anti-tavşan antikorları 1:1000 dilüsyon gibi antikorlar,.
- PBST üç kez kalp örnekleri ile yıkayın (5 dk.) Oda sıcaklığında.
4. Görüntüleme
- PBST çıkarın ve her bir kuyuya 10 ul montaj orta ekleyin. Çözelti berrak olana kadar birkaç dakika süreyle odasının Rock.
- Montaj orta çıkarın ve mikroskop kapağı cam (24x50) ile bir slayt tüm kuyuların kapağı.
- Zeiss Axioplan 2 mikroskop kullanarak balık kalp ApoTome (Carl Zeiss) ile donatılmıştır.
5. Temsilcisi Sonuçlar
Şekil tüm zebrafish kardiyomiyositlerde membran ve çekirdekler gösteren bir görüntü bir örnek gösterilmiştir. 1. mef2c ve β-katenin antikorları, disseke 52 hpf zebrafish embriyo kalp örnekleri leke birlikte kullanılmıştır. Iken mef2c antikor lekeleri kardiyomiyositlerinin çekirdekleri, β-kateninantikor her hücre 8-10 sınırında ortaya koymaktadır. Bileşik mikroskop sahne ayarlayarak, kalp örnekleri görüntüleri aynı yönde, dış eğrilik ve kalp 11 iç eğrilik gözlem sağlayacak şekilde ayarlanabilir. Toplam kardiyomiyosit numarası, kardiyomiyosit hücre boyutu ve dairesellik sonra ölçülebilir.
Şekil embriyonik bir kalbin sarkomerik yapısı ortaya başka bir örnek gösterilmiştir. 2. Biz bir disseke embriyonik kalp F59, miyozin antikor, immün yapıldı. Kalın filament çizgili bir bant, yüksek büyütme (Şekil 2) 6 açıklanacak, bütün bir embriyonik kalp myofibril ağ açıkça daha düşük büyütme açıklanacak.
Şekil 1 mef2 (kırmızı) ve β-katenin (yeşil) çekirdek ve outl göstermek için immünzebrafish ventrikül kardiyomiyositlerinin ines. Ölçek çubuğu = 10μm
Şekil 2 ya da düşük büyütme (A) veya daha yüksek büyütme (B) zebrafish ventrikül kalın filament göstermek için miyozin Immnostaining ölçekli bar = 10μm
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Klasik tüm montaj immün yöntemleri ile karşılaştırıldığında, yöntem, aşağıdaki avantajları vardır. Öncelikle, çok daha güçlü floresan sinyalleri sürekli olarak geliştirilmiş penetrasyon nedeniyle elde edilebilir. Tüm montaj immün yöntemi, kalp çevresindeki yoğun cilt dokusu, tüm vücut önemli ölçüde yüksek arka planda birçok antikor penetrasyon azalır. Bu sorun özellikle büyük embriyolar için 3 gün sonrası fertilizasyon (dpf) şiddetlidir. Disseke kalpleri aksine, sadece çok daha iyi bir penetrasyon render birkaç hücre tabakaları oluşur. İkincisi, çünkü çok gelişmiş penetrasyon, tüm immün süreci 1 gün sadece birkaç saat azaltılabilir. Biz başarıyla aktinin, Integin bağlantılı kinaz (Ilk) ve β-katenin spesifik antikorlar gibi bazı antikorlar için 1 saat 30 dakika inkübasyon süresi kısalır. Üçüncü olarak, yüksek çözünürlüklü görüntüler sürekli olarak bozulmamış kalpleri elde edilebilirhücre / hücre içi bilgileri ortaya çıkarmak için. Çünkü, yumurta sarısı yanında pericardiac kesesi içinde kalp localisation görüntü sağlam embriyolar, yüksek büyütme amacı lensler kullanılmalıdır. Bu nedenle, kalp, sağlam bir kalp görüntülerinin gerektiği disseke gerekecektir. Ancak, bu tür embriyoların zayıflatmak tüm montaj boyama işlemi penetrasyonunu artırmak için kullanılır triton-x-100 gibi deterjanlar. Bunun bir sonucu olarak, kupa diseksiyon işlemi sırasında kolayca kırılır. Buna karşılık, canlı kalp komşu dokulardan kolaylıkla ayrılabilir, çok güçlüdür. Bu nedenle, sağlam morfolojisi daha kolay önerilen yöntem kullanılarak korunur. Küçük bir Zebra balığı kalp diseksiyon zor görünebilir olmasına rağmen, çoğu insan kolayca çeşitli uygulamalarından sonra bu yordamı gerçekleştirebilirsiniz.
Biz bu yöntemi kullanılmıştır dpf'e 2 dpf'e ila 6 yaş arasındaki kalpleri leke var. Fiziksel konumu, hatta kont kalpleri nedeniyleier embriyolar incelemek zor düzenledi. Bu yöntem larva veya yetişkin kalpleri için ayarlanabilir olup olmadığı tespit edilecek kalır. Bu fiziksel güç gerektirir diseksiyon işlemi sırasında kalp için yerel hasara neden olabileceğini işaret değer. Bu komplikasyon birçok kalpleri değerlendirmek ve tutarlı sonuçlar elde etmek ve en iyi muhafaza morfolojisi görüntüleri seçerek üstesinden gelinebilir.
Çünkü çok gelişmiş çözünürlük, gelişmekte olan bir Zebra balığı kalp hem hücresel ve hücre içi yapıları ortaya çıkarmak için bu yöntem kullanılabilir. Örneğin, biz zaten proliferasyonu ve apoptozis değerlendirmek için bireysel kardiyomiyosit boyutunu ölçmek için, kardiyomiyositlerde toplam sayısını saymak ve sarkomer montaj 6,12 sürecinde ortaya çıkarmak için bu yöntemi uyguladık. Zebrafish benzersiz genetik araçları ile birlikte, mevcut yöntem in vivo modeldir bu çalışmada kardiyovasküler biyoloji kolaylaştıracaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Biz Beninio Jomok Zebra balığı yetiştiriciliği yaptığı yardım için teşekkür ederim. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüsü, HL81753 tarafından finanse edilmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| tricaine | Research organics | 3007T | |
| Formaldehyde | Polysciences, Inc. | 04018 | |
| Insulin syringe | BD Biosciences | 329461 | |
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | T8532 | |
| Anti-β-catenin antibody | Sigma-Aldrich | C7207 | |
| Anti-Mef2c antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC313 | |
| F59 | Zfin | ||
| Anti-α-actinin antibody | Sigma-Aldrich | A7811 | |
| Anti-Ilk antibody | Cell Signaling Technology | #3862 | |
| Alexa fluor 568 Goat anti rabbit IgG | Invitrogen | A11011 | |
| Alexa fluor 488 Goat anti mouse IgG1 | Invitrogen | A21121 | |
| Mounting medium for fluorescence | Vector Laboratories | H-1200 | |
| ImmEdge pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Poly-L-lysin coated slides | Electron Microscopy Sciences | 63410-01 | |
| Microscope cover glass | Fisher Scientific | 12-543-D | |
| Concaved microscope slides | Fisher Scientific | 7-1305-8 | |
| Dissection microscope | Leica Microsystems | ||
| Compound microscope | Carl Zeiss, Inc. | Axioplan2 | |
| ApoTome | Carl Zeiss, Inc. | ||
| PBST: 1 x PBS 0.5% Triton-X 100 |
|||
| 25X Tricaine: 400 mg Tricaine 97.9 mL ddH2O 2.1 mL (1M Tris pH9) Adjust pH to 7.0 |
|||
References
- Shin, J. T., Fishman, M. C. From Zebrafish to human: modular medical models. Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 3, 311-340 (2002).
- Beis, D., Stainier, D. Y. In vivo cell biology: following the zebrafish trend. Trends. Cell. Biol. 16, 105-112 (2006).
- Schoenebeck, J. J., Yelon, D. Illuminating cardiac development: Advances in imaging add new dimensions to the utility of zebrafish genetics. Semin. Cell. Dev. Biol. 18, 27-35 (2007).
- Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish. Nat. Genet. 26, 216-220 (2000).
- Dahme, T., Katus, H. A., Rottbauer, W. Fishing for the genetic basis of cardiovascular disease. Dis. Model Mech. 2, 18-22 (2009).
- Huang, W., Zhang, R., Xu, X. Myofibrillogenesis in the developing zebrafish heart: A functional study of tnnt2. Dev. Biol. 331, 237-249 (2009).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book. , (2007).
- Buckingham, M. E.
- Wheelock, M. J., Knudsen, K. A.
- Sun, X. Cardiac hypertrophy involves both myocyte hypertrophy and hyperplasia in anemic zebrafish. PLoS One. 4, e6596-e6596 (2009).
- Auman, H. J. Functional modulation of cardiac form through regionally confined cell shape changes. PLoS Biol. 5, e53-e53 (2007).
- Chen, Z. Depletion of zebrafish essential and regulatory myosin light chains reduces cardiac function through distinct mechanisms. Cardiovasc. Res. 79, 97-108 (2008).
