تقرير من الطوافة الدهن تقسيم المسابر Fluorescently الموسومة في الخلايا الحية بواسطة التحليل الطيفي الارتباط الإسفار (FCS)
Summary
وصفت وهناك تقنية للتحقيق في تقسيم مجموعة كبيرة من البروتينات الشحمية فلوري في الغشاء البلازمي للخلايا الحية. فإنه يستفيد من التفاوت في أوقات نشر من البروتينات الموجودة داخل أو خارج من الطوافات الدهنية. لا يمكن أن يؤديها اكتساب حيوي في ظروف سيطرة أو بعد إدمان المخدرات.
Abstract
في السنوات الخمس عشرة الماضية أصبحت فكرة أن أغشية الخلايا ليست متجانسة والاعتماد على microdomains لممارسة وظائفها بقبول واسع النطاق. الطوافات الدهنية هي microdomains غشاء المخصب في الكولسترول وsphingolipids. انها تلعب دورا في العمليات الفيزيولوجية الخلوية مثل الإشارات، و1،2 الاتجار لكن يعتقد أيضا أن يكون لاعب رئيسي في العديد من الأمراض بما في ذلك العدوى الفيروسية أو البكتيرية وأمراض الاعصاب 3.
بعد وجودها لا يزال مثار جدل 4،5. في الواقع، فقد قدر حجم الدهون طوف أن يكون حوالي 20 نانومتر 6، حتى في إطار الحد الأقصى من قرار المجهري التقليدية (حوالي 200 نانومتر)، مما حال دون التصوير المباشر. حتى الآن، وكانت التقنيات الرئيسية المستخدمة لتقييم قسم من البروتينات ذات الاهتمام داخل الطوافات الدهنية أغشية مقاومة للمنظفات (DRMS) العزلة وشارك في التصحيح، مع الأجسام المضادة. على الرغم من استخدامها على نطاق واسع بيكاوكانت هذه التقنيات استخدام تنفيذها سهل نوعا ما، عرضة لالمصنوعات اليدوية، وانتقد وبالتالي 7،8. وكانت التحسينات التقنية اللازمة لذلك للتغلب على هذه المصنوعات اليدوية، وتكون قادرة على تحقيق دهن الطوافات التقسيم في الخلايا الحية.
هنا نقدم طريقة لتحليل الحساسية من تقسيم الطوافات الدهنية من البروتينات fluorescently الموسومة أو الدهون في الغشاء البلازمي للخلايا الحية. هذا الأسلوب، ووصف الإسفار الارتباط الطيفي (FCS)، تعتمد على تفاوت في الأوقات نشر تحقيقات نيون الواقعة داخل أو خارج من الطوافات الدهنية. في الواقع، كما يتضح في كل من الأغشية الاصطناعية والثقافات الخلية، ونشر تحقيقات أسرع بكثير خارج من داخل الطوافات الدهنية الكثيفة 9،10. لتحديد الأوقات ونشرها، وتقاس التقلبات مضان دقيقة بوصفها وظيفة من الوقت في وحدة التنسيق (ما يقرب من 1 فيمتولتر)، التي تقع في الغشاء البلازمي للخلايا مع المجهر متحد البؤر (الشكل1). ويمكن بعد ذلك منحنيات لصناعة السيارات في ارتباط يمكن استخلاصها من هذه التقلبات ومزودة نماذج ملائمة لنشر الرياضية 11.
ويمكن استخدام FCS لتحديد مجموعة كبيرة من الدهون تقسيم تحقيقات مختلفة، طالما يتم تمييزها fluorescently هم. لا يمكن أن يتحقق عن طريق وضع علامات فلوري التعبير عن البروتينات الانصهار فلوري أو عن طريق الربط من يغاندس فلوري. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام FCS ليس فقط في الأغشية الاصطناعية وخطوط الخلية ولكن أيضا في الثقافات الأولية، كما هو موضح في الآونة الأخيرة 12. ويمكن أيضا استخدامه لمتابعة ديناميكية تقسيم طوف الدهون بعد إضافة عقار أو تغيير تكوين الغشاء الدهني 12.
Protocol
Discussion
طريقة FCS المقدمة هنا يمكن تحليل الحساسة والسريعة للدهن تقسيم مجموعة من المجسات فلوري من الاهتمام في الخلايا الحية. FCS يجمع بين دقة الترجمة من متحد البؤر المجهري مع حساسية العد فوتون واحد. والفرق الرئيسي بين السفح والتقنيات الحيوية هو معيار أن FCS تمكن من تحديد المطلقة ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل عن طريق منحة من الوكالة الوطنية للبحوث دي لا (ChoAD). ونحن أيضا ممتنون لمؤسسة اي سي ام (معهد دو Cerveau آخرون دي لا Moelle) لما قدموه من دعم مالي.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Cholera toxin subunit B-Alexa 488 | Invitrogen | C-34775 | MW (pentamer) = 57 kg/mol |
| Confocal microscope | Leica | SP5 | |
| Incubator for temperature and CO2 control | Life imaging services | The Cube and the Box | |
| SPAD (Single Photon Avalanche Diode) | MPD (Micro Photon Devices) | PDM serie (100 μm sensitive area) | |
| High pass 488 nm filter | Semrock | 488 nm blocking edge BrightLine long-pass filter Part # FF01-488/LP-25 |
|
| FCS detection unit | Picoquant | Picoharp 300 module | |
| Acquisition and auto-correlation software | Picoquant | SymPhoTime | |
| Fitting software | OriginLab | OriginPro8 |
References
- Brown, D. A., London, E. Functions of lipid rafts in biological membranes. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 14, 111-136 (1998).
- Simons, K., Gerl, M. J. Revitalizing membrane rafts: new tools and insights. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 688-699 (2010).
- Simons, K., Ehehalt, R. Cholesterol, lipid rafts, and disease. J. Clin. Invest. 110, 597-603 (2002).
- Munro, S. Lipid rafts: elusive or illusive. Cell. , 115-377 (2003).
- Shaw, A. S. Lipid rafts: now you see them, now you don’t. Nat. Immunol. 7, 1139-1142 (2006).
- Pralle, A., Keller, P., Florin, E. L., Simons, K., Horber, J. K. Sphingolipid-cholesterol rafts diffuse as small entities in the plasma membrane of mammalian cells. J. Cell Biol. 148, 997-1008 (2000).
- Brown, D. A., London, E. Structure and function of sphingolipid- and cholesterol-rich membrane rafts. J. Biol Chem. 275, 17221-17224 (2000).
- Sharma, P., Sabharanjak, S., Mayor, S. Endocytosis of lipid rafts: an identity crisis. Semin. Cell Dev. Biol. 13, 205-214 (2002).
- Kahya, N., Scherfeld, D., Bacia, K., Poolman, B., Schwille, P. Probing lipid mobility of raft-exhibiting model membranes by fluorescence correlation spectroscopy. J. Biol. Chem. 278, 28109-28115 (2003).
- Bacia, K., Scherfeld, D., Kahya, N., Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy relates rafts in model and native membranes. Biophys J. 87, 1034-1043 (2004).
- Kim, S. A., Heinze, K. G., Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy in living cells. Nat. Methods. 4, 963-973 (2007).
- Marquer, C. Local cholesterol increase triggers amyloid precursor protein-Bace1 clustering in lipid rafts and rapid endocytosis. FASEB J. 25, 1295-1305 (2011).
- Tian, Y., Martinez, M. M., Pappas, D. Fluorescence correlation spectroscopy: a review of biochemical and microfluidic applications. Appl. Spectrosc. 65, 115A-124A (2011).
- Haustein, E., Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy: novel variations of an established technique. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 36, 151-169 (2007).
- Ilien, B. Pirenzepine promotes the dimerization of muscarinic M1 receptors through a three-step binding process. J. Biol. Chem. 284, 19533-19543 (2009).
- Lieto, A. M., Cush, R. C., Thompson, N. L. Ligand-receptor kinetics measured by total internal reflection with fluorescence correlation spectroscopy. Biophys. J. 85, 3294-3302 (2003).
- Thompson, N. L., Burghardt, T. P., Axelrod, D. Measuring surface dynamics of biomolecules by total internal reflection fluorescence with photobleaching recovery or correlation spectroscopy. Biophys. J. 33, 435-454 (1981).
- Thompson, N. L., Steele, B. L. Total internal reflection with fluorescence correlation spectroscopy. Nat. Protoc. 2, 878-890 (2007).
- Eggeling, C. Direct observation of the nanoscale dynamics of membrane lipids in a living cell. Nature. 457, 1159-1162 (2009).
- Kolin, D. L., Wiseman, P. W. Advances in image correlation spectroscopy: measuring number densities, aggregation states, and dynamics of fluorescently labeled macromolecules in cells. Cell Biochem. Biophys. 49, 141-164 (2007).
- Shvartsman, D. E., Kotler, M., Tall, R. D., Roth, M. G., Henis, Y. I. Differently anchored influenza hemagglutinin mutants display distinct interaction dynamics with mutual rafts. J. Cell Biol. 163, 879-888 (2003).
- White, R. Holin triggering in real time. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 798-803 (2011).
- Petersen, N. O., Hoddelius, P. L., Wiseman, P. W., Seger, O., Magnusson, K. E. Quantitation of membrane receptor distributions by image correlation spectroscopy: concept and application. Biophys. J. 65, 1135-1146 (1993).
- Hebert, B., Costantino, S., Wiseman, P. W. Spatiotemporal image correlation spectroscopy (STICS) theory, verification, and application to protein velocity mapping in living CHO cells. Biophys. J. 88, 3601-3614 (2005).
- Digman, M. A. Measuring fast dynamics in solutions and cells with a laser scanning microscope. Biophys. J. 89, 1317-1327 (2005).
- Digman, M. A. Fluctuation correlation spectroscopy with a laser-scanning microscope: exploiting the hidden time structure. Biophys. J. 88, L33-L36 (2005).
- Nohe, A., Keating, E., Fivaz, M., van der Goot, F. G., Petersen, N. O. Dynamics of GPI-anchored proteins on the surface of living cells. Nanomedicine. 2, 1-7 (2006).
- Semrau, S., Schmidt, T. Particle image correlation spectroscopy (PICS): retrieving nanometer-scale correlations from high-density single-molecule position data. Biophys. J. 92, 613-621 (2007).
- Bates, I. R. Membrane lateral diffusion and capture of CFTR within transient confinement zones. Biophys. J. 91, 1046-1058 (2006).
