קביעת רפסודה ליפידים חלוקת בדיקות fluorescently-מתוייגים בתאים חיים באמצעות מתאם ספקטרוסקופיה פלואורסצנטי (FCS)
Summary
טכניקה לחקור את הרפסודה השומנים חלוקה של חלבונים ניאון על הממברנה של התאים החיים המתואר. הוא מנצל את הפער בזמנים דיפוזיה של חלבונים המצויים בתוך או מחוץ רפסודות שומנים בדם. הרכישה יכולה להתבצע באופן דינמי בתנאי בקרה, או אחרי כן התרופה.
Abstract
בחמש עשרה השנים האחרונות את הרעיון קרום התא לא הומוגנית להסתמך על microdomains להפעיל פונקציות שלהם הפכה מקובלת מאוד. רפסודות שומנים בדם הם microdomains קרום המועשר כולסטרול sphingolipids. הם ממלאים תפקיד בתהליכים פיזיולוגיים הסלולר כגון איתות, ו 1,2 סחר אבל נחשבים גם להיות שחקני מפתח מחלות שונות, כולל זיהומים נגיפיים או חיידקים ומחלות ניווניות 3.
עם זאת, קיומם הוא עדיין עניין של מחלוקת 4,5. אכן, רפסודה בגודל שומנים בדם כבר מוערך כ 20 ננומטר 6, הרבה מתחת לגבול הרזולוציה של מיקרוסקופ רגיל (סביב 200 ננומטר), ובכך precluding הדמיה ישירה שלהם. עד עכשיו, את הטכניקות העיקריות להערכת החלוקה של חלבונים בעלי עניין בתוך רפסודות שומנים בדם היו ממברנות עמידות דטרגנט (DRMs) בידוד ושיתוף תיקון עם נוגדנים. למרות שימוש נרחב becaהשימוש ביישום די קל שלהם, טכניקות אלה היו מועדים חפצים ובכך מתח ביקורת על 7,8. שיפורים טכניים היו לכן, יש להתגבר על חפצים כדי להיות מסוגל לחקור רפסודות מחיצה שומנים בתאים חיים.
כאן אנו מציגים שיטה ניתוח רגישות של מחיצת רפסודות שומנים בדם של חלבונים או שומנים fluorescently-מתוייגים בקרום פלזמה של תאים חיים. שיטה זו, המכונה ספקטרוסקופיה מתאם פלואורסצנטי (FCS), מסתמך על הפער בזמנים דיפוזיה של בדיקות ניאון הממוקמים או מחוצה לו, רפסודות שומנים בדם. למעשה, כפי שעולה הן ממברנות מלאכותיים בתרביות תאים, בדיקות היה לפזר הרבה יותר מהר מאשר בחוץ בתוך רפסודות שומנים בדם צפופים 9,10. כדי לקבוע את הזמנים דיפוזיה, תנודות זעירות הקרינה נמדדים כפונקציה של הזמן בנפח מוקד (כ 1 femtoliter), הממוקם בקרום הפלסמה של התאים באמצעות מיקרוסקופ confocal (איור1). אוטומטי המתאם עיקולים לאחר מכן, ניתן להסיק שינויים אלו מצויד המתאימים מודלים מתמטיים דיפוזיה 11.
FCS ניתן להשתמש כדי לקבוע את הרפסודה השומנים מחיצות של בדיקות שונות, כל עוד הם מתויגים fluorescently. תיוג פלורסנט ניתן להשיג על ידי ביטוי של חלבונים היתוך ניאון או באמצעות קשירה של ligands ניאון. יתר על כן, FCS יכול לשמש לא רק ממברנות מלאכותיים שורות תאים, אלא גם בתרבויות העיקריות, כפי שתואר לאחרונה 12. זה יכול לשמש גם כדי לעקוב אחר הדינמיקה של חלוקת השומנים הרפסודה לאחר הוספת התרופה או שינוי הרכב השומנים קרום 12.
Protocol
Discussion
שיטת FCS המוצג כאן מאפשר ניתוח רגיש מהירה של חלוקת השומנים הרפסודה של בדיקות ניאון של עניין תאים חיים. FCS המשלבת את הדיוק של לוקליזציה של מיקרוסקופיה confocal עם רגישות של ספירת פוטון יחיד. ההבדל העיקרי בין FCS וטכניקות ביוכימיים התקן היא זאת FCS מאפשר קביעה מוחלטת של חלוקת הש…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענק מטעם סוכנות הידיעות הלאומית דה לה משוכלל ונדיר (ChoAD). אנחנו גם מודים ICM Fondation (Institut du Cerveau et de la Moelle) עבור תמיכה כלכלית שלהם.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Cholera toxin subunit B-Alexa 488 | Invitrogen | C-34775 | MW (pentamer) = 57 kg/mol |
| Confocal microscope | Leica | SP5 | |
| Incubator for temperature and CO2 control | Life imaging services | The Cube and the Box | |
| SPAD (Single Photon Avalanche Diode) | MPD (Micro Photon Devices) | PDM serie (100 μm sensitive area) | |
| High pass 488 nm filter | Semrock | 488 nm blocking edge BrightLine long-pass filter Part # FF01-488/LP-25 |
|
| FCS detection unit | Picoquant | Picoharp 300 module | |
| Acquisition and auto-correlation software | Picoquant | SymPhoTime | |
| Fitting software | OriginLab | OriginPro8 |
References
- Brown, D. A., London, E. Functions of lipid rafts in biological membranes. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 14, 111-136 (1998).
- Simons, K., Gerl, M. J. Revitalizing membrane rafts: new tools and insights. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 688-699 (2010).
- Simons, K., Ehehalt, R. Cholesterol, lipid rafts, and disease. J. Clin. Invest. 110, 597-603 (2002).
- Munro, S. Lipid rafts: elusive or illusive. Cell. , 115-377 (2003).
- Shaw, A. S. Lipid rafts: now you see them, now you don’t. Nat. Immunol. 7, 1139-1142 (2006).
- Pralle, A., Keller, P., Florin, E. L., Simons, K., Horber, J. K. Sphingolipid-cholesterol rafts diffuse as small entities in the plasma membrane of mammalian cells. J. Cell Biol. 148, 997-1008 (2000).
- Brown, D. A., London, E. Structure and function of sphingolipid- and cholesterol-rich membrane rafts. J. Biol Chem. 275, 17221-17224 (2000).
- Sharma, P., Sabharanjak, S., Mayor, S. Endocytosis of lipid rafts: an identity crisis. Semin. Cell Dev. Biol. 13, 205-214 (2002).
- Kahya, N., Scherfeld, D., Bacia, K., Poolman, B., Schwille, P. Probing lipid mobility of raft-exhibiting model membranes by fluorescence correlation spectroscopy. J. Biol. Chem. 278, 28109-28115 (2003).
- Bacia, K., Scherfeld, D., Kahya, N., Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy relates rafts in model and native membranes. Biophys J. 87, 1034-1043 (2004).
- Kim, S. A., Heinze, K. G., Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy in living cells. Nat. Methods. 4, 963-973 (2007).
- Marquer, C. Local cholesterol increase triggers amyloid precursor protein-Bace1 clustering in lipid rafts and rapid endocytosis. FASEB J. 25, 1295-1305 (2011).
- Tian, Y., Martinez, M. M., Pappas, D. Fluorescence correlation spectroscopy: a review of biochemical and microfluidic applications. Appl. Spectrosc. 65, 115A-124A (2011).
- Haustein, E., Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy: novel variations of an established technique. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 36, 151-169 (2007).
- Ilien, B. Pirenzepine promotes the dimerization of muscarinic M1 receptors through a three-step binding process. J. Biol. Chem. 284, 19533-19543 (2009).
- Lieto, A. M., Cush, R. C., Thompson, N. L. Ligand-receptor kinetics measured by total internal reflection with fluorescence correlation spectroscopy. Biophys. J. 85, 3294-3302 (2003).
- Thompson, N. L., Burghardt, T. P., Axelrod, D. Measuring surface dynamics of biomolecules by total internal reflection fluorescence with photobleaching recovery or correlation spectroscopy. Biophys. J. 33, 435-454 (1981).
- Thompson, N. L., Steele, B. L. Total internal reflection with fluorescence correlation spectroscopy. Nat. Protoc. 2, 878-890 (2007).
- Eggeling, C. Direct observation of the nanoscale dynamics of membrane lipids in a living cell. Nature. 457, 1159-1162 (2009).
- Kolin, D. L., Wiseman, P. W. Advances in image correlation spectroscopy: measuring number densities, aggregation states, and dynamics of fluorescently labeled macromolecules in cells. Cell Biochem. Biophys. 49, 141-164 (2007).
- Shvartsman, D. E., Kotler, M., Tall, R. D., Roth, M. G., Henis, Y. I. Differently anchored influenza hemagglutinin mutants display distinct interaction dynamics with mutual rafts. J. Cell Biol. 163, 879-888 (2003).
- White, R. Holin triggering in real time. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 798-803 (2011).
- Petersen, N. O., Hoddelius, P. L., Wiseman, P. W., Seger, O., Magnusson, K. E. Quantitation of membrane receptor distributions by image correlation spectroscopy: concept and application. Biophys. J. 65, 1135-1146 (1993).
- Hebert, B., Costantino, S., Wiseman, P. W. Spatiotemporal image correlation spectroscopy (STICS) theory, verification, and application to protein velocity mapping in living CHO cells. Biophys. J. 88, 3601-3614 (2005).
- Digman, M. A. Measuring fast dynamics in solutions and cells with a laser scanning microscope. Biophys. J. 89, 1317-1327 (2005).
- Digman, M. A. Fluctuation correlation spectroscopy with a laser-scanning microscope: exploiting the hidden time structure. Biophys. J. 88, L33-L36 (2005).
- Nohe, A., Keating, E., Fivaz, M., van der Goot, F. G., Petersen, N. O. Dynamics of GPI-anchored proteins on the surface of living cells. Nanomedicine. 2, 1-7 (2006).
- Semrau, S., Schmidt, T. Particle image correlation spectroscopy (PICS): retrieving nanometer-scale correlations from high-density single-molecule position data. Biophys. J. 92, 613-621 (2007).
- Bates, I. R. Membrane lateral diffusion and capture of CFTR within transient confinement zones. Biophys. J. 91, 1046-1058 (2006).
