Bestemmelse af lipidklump opdeling af fluorescens-mærkede prober i levende celler ved fluorescenskorrelationsspektroskopi (FCS)
Summary
En teknik til at undersøge lipidklump opdelingen af fluorescerende proteiner til plasmamembranen af levende celler er beskrevet. Den udnytter forskellen i diffusionstider for proteiner i eller uden for lipidklumper. Erhvervelse kan udføres dynamisk i kontrol betingelser eller efter narkotika tilsætning.
Abstract
I de sidste femten år den opfattelse, at cellemembraner ikke er homogene og stole på mikrodomæner at udøve deres funktioner er blevet bredt accepteret. Lipidklumper er membran mikrodomæner beriget med cholesterol og sphingolipider. De spiller en rolle i cellulære fysiologiske processer, såsom signalering, og handel 1,2, men er også menes at være centrale aktører i en række sygdomme, herunder virale eller bakterielle infektioner og neurodegenerative sygdomme 3.
Men deres eksistens er stadig et spørgsmål om uenighed 4,5. Faktisk har lipidklump størrelse er anslået til at være omkring 20 nm 6, langt under opløsning grænse for konventionel mikroskopi (ca. 200 nm), således til hinder for deres direkte billeddannelse. Indtil nu, var de vigtigste teknikker, der anvendes til at vurdere delingen af proteiner af interesse inde lipidklumperne Vaskemiddel Resistant Membraner (DRM) isolation og co-lappe med antistoffer. Selvom udbredt becabrug af deres ret let gennemføres, disse teknikker var tilbøjelige til artefakter og dermed kritiseret 7,8. Tekniske forbedringer var derfor nødvendigt at overvinde disse artefakter og at være i stand til at undersøge lipidklumper skillevæg i levende celler.
Her præsenterer en fremgangsmåde til følsom analyse af lipidklumper delingen af fluorescens-mærkede proteiner eller lipider i plasmamembranen af levende celler. Denne fremgangsmåde betegnes fluorescenskorrelationsspektroskopi (FCS), baseret på forskellene i udbredelse tider fluorescerende sonder eller udenfor lipidklumper. Faktisk, som det ses i både kunstige membraner og cellekulturer vil proberne diffundere meget hurtigere uden end indersiden tætte lipidklumper 9,10. At bestemme diffusion gange, minutters fluorescens udsving målt som en funktion af tid i en fokal volumen (ca. 1 femtoliter), placeret på plasmamembranen af celler med et konfokalt mikroskop (fig.1). Autokorrelationen kurver kan derefter trækkes af disse udsving og forsynet med passende matematiske diffusionsmodeller 11.
FCS kan anvendes til at bestemme lipidklump opdeling af forskellige prober, så længe de fluorescerende er kodet. Fluorescerende mærkning kan opnås ved ekspression af fluorescerende fusionsproteiner eller ved binding af fluorescerende ligander. Endvidere kan FCS kan ikke blot anvendes i kunstige membraner og cellelinier, men også i primære kulturer, som beskrevet for nylig 12. Det kan også anvendes til at følge dynamik lipidklump separation efter lægemiddelindgivelse tilsætning eller membran lipidsammensætningen ændring 12.
Protocol
Discussion
FCS Fremgangsmåden præsenteret her muliggør en følsom og hurtig analyse af lipidklump opdelingen af fluorescerende prober af interesse i levende celler. FCS kombinerer nøjagtigheden af placeringen af konfokal mikroskopi med følsomheden af en enkelt foton-tælling. Den største forskel mellem FCS og standard biokemiske teknikker er, at FCS muliggør absolut bestemmelse af lipidklumper deling af målet og ikke den relative partition som det er tilfældet for DRM isolering eller co-lapning. </…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af en bevilling fra Agence Nationale de la Recherche (ChoAD). Vi er også taknemmelige for den Fondation ICM (Institut du Cerveau et de la Moelle) for deres økonomiske støtte.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Cholera toxin subunit B-Alexa 488 | Invitrogen | C-34775 | MW (pentamer) = 57 kg/mol |
| Confocal microscope | Leica | SP5 | |
| Incubator for temperature and CO2 control | Life imaging services | The Cube and the Box | |
| SPAD (Single Photon Avalanche Diode) | MPD (Micro Photon Devices) | PDM serie (100 μm sensitive area) | |
| High pass 488 nm filter | Semrock | 488 nm blocking edge BrightLine long-pass filter Part # FF01-488/LP-25 |
|
| FCS detection unit | Picoquant | Picoharp 300 module | |
| Acquisition and auto-correlation software | Picoquant | SymPhoTime | |
| Fitting software | OriginLab | OriginPro8 |
References
- Brown, D. A., London, E. Functions of lipid rafts in biological membranes. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 14, 111-136 (1998).
- Simons, K., Gerl, M. J. Revitalizing membrane rafts: new tools and insights. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 688-699 (2010).
- Simons, K., Ehehalt, R. Cholesterol, lipid rafts, and disease. J. Clin. Invest. 110, 597-603 (2002).
- Munro, S. Lipid rafts: elusive or illusive. Cell. , 115-377 (2003).
- Shaw, A. S. Lipid rafts: now you see them, now you don’t. Nat. Immunol. 7, 1139-1142 (2006).
- Pralle, A., Keller, P., Florin, E. L., Simons, K., Horber, J. K. Sphingolipid-cholesterol rafts diffuse as small entities in the plasma membrane of mammalian cells. J. Cell Biol. 148, 997-1008 (2000).
- Brown, D. A., London, E. Structure and function of sphingolipid- and cholesterol-rich membrane rafts. J. Biol Chem. 275, 17221-17224 (2000).
- Sharma, P., Sabharanjak, S., Mayor, S. Endocytosis of lipid rafts: an identity crisis. Semin. Cell Dev. Biol. 13, 205-214 (2002).
- Kahya, N., Scherfeld, D., Bacia, K., Poolman, B., Schwille, P. Probing lipid mobility of raft-exhibiting model membranes by fluorescence correlation spectroscopy. J. Biol. Chem. 278, 28109-28115 (2003).
- Bacia, K., Scherfeld, D., Kahya, N., Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy relates rafts in model and native membranes. Biophys J. 87, 1034-1043 (2004).
- Kim, S. A., Heinze, K. G., Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy in living cells. Nat. Methods. 4, 963-973 (2007).
- Marquer, C. Local cholesterol increase triggers amyloid precursor protein-Bace1 clustering in lipid rafts and rapid endocytosis. FASEB J. 25, 1295-1305 (2011).
- Tian, Y., Martinez, M. M., Pappas, D. Fluorescence correlation spectroscopy: a review of biochemical and microfluidic applications. Appl. Spectrosc. 65, 115A-124A (2011).
- Haustein, E., Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy: novel variations of an established technique. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 36, 151-169 (2007).
- Ilien, B. Pirenzepine promotes the dimerization of muscarinic M1 receptors through a three-step binding process. J. Biol. Chem. 284, 19533-19543 (2009).
- Lieto, A. M., Cush, R. C., Thompson, N. L. Ligand-receptor kinetics measured by total internal reflection with fluorescence correlation spectroscopy. Biophys. J. 85, 3294-3302 (2003).
- Thompson, N. L., Burghardt, T. P., Axelrod, D. Measuring surface dynamics of biomolecules by total internal reflection fluorescence with photobleaching recovery or correlation spectroscopy. Biophys. J. 33, 435-454 (1981).
- Thompson, N. L., Steele, B. L. Total internal reflection with fluorescence correlation spectroscopy. Nat. Protoc. 2, 878-890 (2007).
- Eggeling, C. Direct observation of the nanoscale dynamics of membrane lipids in a living cell. Nature. 457, 1159-1162 (2009).
- Kolin, D. L., Wiseman, P. W. Advances in image correlation spectroscopy: measuring number densities, aggregation states, and dynamics of fluorescently labeled macromolecules in cells. Cell Biochem. Biophys. 49, 141-164 (2007).
- Shvartsman, D. E., Kotler, M., Tall, R. D., Roth, M. G., Henis, Y. I. Differently anchored influenza hemagglutinin mutants display distinct interaction dynamics with mutual rafts. J. Cell Biol. 163, 879-888 (2003).
- White, R. Holin triggering in real time. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 798-803 (2011).
- Petersen, N. O., Hoddelius, P. L., Wiseman, P. W., Seger, O., Magnusson, K. E. Quantitation of membrane receptor distributions by image correlation spectroscopy: concept and application. Biophys. J. 65, 1135-1146 (1993).
- Hebert, B., Costantino, S., Wiseman, P. W. Spatiotemporal image correlation spectroscopy (STICS) theory, verification, and application to protein velocity mapping in living CHO cells. Biophys. J. 88, 3601-3614 (2005).
- Digman, M. A. Measuring fast dynamics in solutions and cells with a laser scanning microscope. Biophys. J. 89, 1317-1327 (2005).
- Digman, M. A. Fluctuation correlation spectroscopy with a laser-scanning microscope: exploiting the hidden time structure. Biophys. J. 88, L33-L36 (2005).
- Nohe, A., Keating, E., Fivaz, M., van der Goot, F. G., Petersen, N. O. Dynamics of GPI-anchored proteins on the surface of living cells. Nanomedicine. 2, 1-7 (2006).
- Semrau, S., Schmidt, T. Particle image correlation spectroscopy (PICS): retrieving nanometer-scale correlations from high-density single-molecule position data. Biophys. J. 92, 613-621 (2007).
- Bates, I. R. Membrane lateral diffusion and capture of CFTR within transient confinement zones. Biophys. J. 91, 1046-1058 (2006).
