Germ trapianto di cellule e di tessuto testicolare xenotrapianto in topi

Summary

I protocolli per il trapianto di cellule germinali e xenotrapianto tessuto testicolare sono descritti. Trapianto di cellule germinali risultati in donatori-derived spermatogenesi nei testicoli dei destinatari e rappresenta un test funzionale ricostituzione per l'identificazione delle cellule staminali spermatogoni (SSC). Tessuto testicolare xenotrapianto riproduce sviluppo dei testicoli e la spermatogenesi di specie diverse donatori in topi riceventi.

Abstract

Trapianto di cellule germinali è stato sviluppato dal Dr. Ralph Brinster e colleghi presso la University of Pennsylvania nel 1994 ^1,2. Queste rivoluzionarie studi hanno dimostrato che microiniezione di cellule germinali di topi donatori fertili nei tubuli seminiferi dei risultati infertili topi riceventi del donatore-derivato spermatogenesi e la produzione di spermatozoi da parte dell'animale ricevente ^2. L'uso dei maschi donatori che trasportano il batterico β-galattosidasi identificazione del gene consentito di donatore-derivato spermatogenesi e trasmissione della aplotipo donatore alla prole dagli animali beneficiarie ^1. Sorprendentemente, dopo il trapianto nel lume dei tubuli seminiferi, cellule germinali trapiantate riusciti a spostare dal vano luminale alla membrana interrato dove sono spermatogoni ^3. E 'generalmente accettato che SSCs solo sono in grado di colonizzare la nicchia e ristabilire la spermatogenesi nel testicolo destinatario. Pertanto, cellule germinalitrapianto fornisce un approccio funzionale per studiare la nicchia delle cellule staminali nei testicoli e per caratterizzare le cellule staminali putativi spermatogoni. Per data, trapianto di cellule germinali viene utilizzato per delucidare di base biologia delle cellule staminali, per produrre animali transgenici attraverso manipolazione genetica di cellule germinali precedente al trapianto di ^4,5, per studiare Sertoli cell-germinali interazione cellulare ^6,7, SSC homing e colonizzazione ^{3, 8,} così come SSC self-renewal e la differenziazione ^9,10.

Trapianto di cellule Germ è anche realizzabile in ¹¹ specie di grandi dimensioni. In queste, le principali applicazioni sono la conservazione della fertilità, la diffusione della genetica nelle popolazioni animali d'elite, e la generazione di animali transgenici come lo studio della spermatogenesi e la biologia SSC con questa tecnica è logisticamente più difficile e costoso rispetto ai roditori. Il trapianto di cellule germinali di specie di grandi dimensioni nei tubuli seminiferi dei risultati topi in colonizationi di cellule del donatore e l'espansione spermatogoni, ma non nella loro piena differenziazione presumibilmente a causa di incompatibilità della cellula ricevente vano somatiche con le cellule germinali di specie filogeneticamente distanti ^12. Un approccio alternativo è il trapianto di cellule germinali di specie di grandi dimensioni, insieme con il loro vano circostante somatica. Siamo la prima volta nel 2002, che piccoli frammenti di tessuto testicolare da maschi immaturi trapiantate sotto la pelle dorsale di topi immunodeficienti sono in grado di sopravvivere e sottoporsi a pieno sviluppo con la produzione di sperma fecondazione competente ^13. Da allora tessuto testicolare xenotrapianto ha dimostrato di avere successo in molte specie ed è emerso come una valida alternativa per studiare lo sviluppo del testicolo e la spermatogenesi di grandi animali nei topi ^14.

Protocol

Germe di trapianto di cellule A. PART nei topi 1. Preparazione di topi riceventi I destinatari devono essere immunologicamente tolleranti (sia geneticamente identiche al donatore o con deficit immunitario) alle cellule del testicolo il donatore. I destinatari devono essere naturalmente privo di spermatogenesi (ad esempio w / w v topi) o impoverito di cellule germinali endogene. Deplezione delle cellule di germe può essere raggiunto da radiazioni o da f…

Discussion

1. Trapianto di cellule germinali

Cellule germinali trapianto fornisce l'unico saggio funzionale per la conferma inequivocabile della presenza di cellule staminali spermatogoniali (SSCs) in una popolazione cellulare. Solo SSCs possono casa e colonizzare la nicchia SSC a livello della membrana basale e avviare donatore-derivato spermatogenesi. Trapianto di cellule germinali ha permesso di studiare e manipolare i CSS in un modo senza precedenti. La tecnica è stata utilizzata per la produzio…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
Collagenase (type IV)	Sigma	C5138
Trypsin-EDTA	Invitrogen	25200-056
DNaseI	Sigma	DN25
DMEM	Invitrogen	31053-028
Trypan blue stain	Invitrogen	15250-061
Nylon mesh cell strainer	BD biosciences	352340 (40μm) 352350 (70μm)
Busulfan	Sigma	B2635
Thin-Wall Glass Capillaries	World Precision Instrument	TW 100-3
BD intramedic plyethylene tubing (PE100)	BD	CA-63018-725
Ethicon 6-0 Silk Suture	Ethicon	706G
Wound clips	BD	427631
Sigmacote	Sigma	SL2
X-gal	Sigma	B4252
Potassium Ferrocyanide	Sigma	P9387
Potassium Ferricyanide	Sigma	P3667
magnesium chloride	Sigma	208337
sodium deoxycholate	Sigma	D6750
N,N-Dimethylformamide	Sigma	D4551
Igepal CA-630	Sigma	18896