Transplante de células germinativas e Tecidos Testículo xeno em Ratos

Summary

Protocolos para transplante de células germinativas e xeno tecidos testiculares são descritos. Germinativas resultados de células de transplante em doador-derivado espermatogênese em testículos beneficiárias, bem como representa um ensaio de reconstituição funcional para identificação de células-tronco espermatogónias (SSCS). Testículo tecido xeno reproduz o desenvolvimento dos testículos e espermatogênese de espécies doadoras diferentes em camundongos receptores.

Abstract

Gérmen de transplante de células foi desenvolvido pelo Dr. Ralph Brinster e colegas da Universidade da Pensilvânia, em 1994, ^1,2. Estes estudos inovadores mostraram que a microinjeção de células germinativas de camundongos doadores férteis no interior dos túbulos seminíferos de ratos inférteis receptor resulta em doador-derivado espermatogênese e produção de espermatozóides pelo animal destinatário ^2. O uso de machos dadores que transportem a identificação gene bacteriano β-galactosidase permitido de doador-derivado espermatogênese e transmissão de o haplótipo o dador até ao a prole, pelos animais, destinatário ^1. Surpreendentemente, após o transplante para dentro do lúmen dos túbulos seminíferos, as células germinativas transplantados eram capaz de se mover a partir do compartimento luminal para a membrana cave, onde espermatogônias estão localizados ^3. É geralmente aceite que SSCs só são capazes de colonizar o nicho e restabelecer a espermatogênese nos testículos beneficiários. Portanto células germinativas,transplante oferece uma abordagem funcional para estudar o nicho de células-tronco nos testículos e caracterizar supostas células-tronco espermatogônias. Até à data, o transplante de células de gérmen é usado para elucidar a biologia célula básica do caule, para produzir animais transgénicos através da manipulação genética de células germinais antes do transplante ^4,5, para estudar de Sertoli interação célula a célula de gérmen de ^6,7, SSC homing e colonização ^{3, 8,} bem como SSC auto-renovação e diferenciação ^9,10.

Transplante de células germinativas é também viável em grandes espécies ^11. Nestes, as principais aplicações são a preservação da fertilidade, a divulgação da genética nas populações animais de elite, e geração de animais transgênicos como o estudo da espermatogênese ea biologia SSC com esta técnica é logisticamente mais difícil e caro do que em roedores. Transplante de células germinais de espécies de grande porte no interior dos túbulos seminíferos de ratos resulta em colonizatíon de células doadoras e de expansão das espermatogónias, mas não na sua plena diferenciação presumivelmente devido à incompatibilidade do compartimento da célula destinatário somática com as células germinativas a partir de espécies filogeneticamente distantes ^12. Uma abordagem alternativa é o transplante de células germinativas a partir de espécies de grandes juntamente com o seu compartimento de somática circundante. Nós relatada pela primeira vez em 2002, de que pequenos fragmentos de tecido testículo a partir de machos imaturos transplantados sob a pele dorsal de camundongos imunodeficientes são capazes de sobreviver e submetidos a um desenvolvimento pleno com a produção de esperma fertilização competente ^13. Desde que, em seguida, tecido testículo xeno-enxerto tem sido mostrado para ser bem sucedido em muitas espécies e emergiu como uma alternativa valiosa para estudar o desenvolvimento dos testículos e espermatogênese de animais de grande porte em camundongos ^14.

Protocol

PARTE A. transplante de células germinativas em camundongos 1. Preparação de camundongos de destinatário Destinatários deve ser imunologicamente tolerante (quer seja geneticamente combinados a doadores ou imuno-deficientes) para as células testiculares dos doadores. Destinatários deve ser ou naturalmente desprovido de espermatogênese (por exemplo, W / W v camundongos) ou empobrecido de células germinais endógenas. Depleção de células Germ p…

Discussion

1. Gérmen de transplante de células

Gérmen de transplante de células fornece o ensaio somente funcional para a confirmação inequívoca de a presença de células-tronco espermatogónias (SSCs) em uma população de células. SSC só pode casa e colonizar o nicho SSC na membrana basal e iniciar doador-derivado espermatogênese. Gérmen de transplante de células tornou possível para estudar e manipular SSCs em uma forma sem precedentes. A técnica tem sido utilizada para produzir animais…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
Collagenase (type IV)	Sigma	C5138
Trypsin-EDTA	Invitrogen	25200-056
DNaseI	Sigma	DN25
DMEM	Invitrogen	31053-028
Trypan blue stain	Invitrogen	15250-061
Nylon mesh cell strainer	BD biosciences	352340 (40μm) 352350 (70μm)
Busulfan	Sigma	B2635
Thin-Wall Glass Capillaries	World Precision Instrument	TW 100-3
BD intramedic plyethylene tubing (PE100)	BD	CA-63018-725
Ethicon 6-0 Silk Suture	Ethicon	706G
Wound clips	BD	427631
Sigmacote	Sigma	SL2
X-gal	Sigma	B4252
Potassium Ferrocyanide	Sigma	P9387
Potassium Ferricyanide	Sigma	P3667
magnesium chloride	Sigma	208337
sodium deoxycholate	Sigma	D6750
N,N-Dimethylformamide	Sigma	D4551
Igepal CA-630	Sigma	18896