Germen de Trasplante de Células y Tejidos Testículos xenotrasplante en ratones

Summary

Los protocolos para el trasplante de células germinales de testículo y el xenotrasplante de tejido se describen. Germen de los resultados de trasplante de células en donantes derivado de la espermatogénesis en los testículos receptores y representa un ensayo de reconstitución funcional para la identificación de células madre de espermatogonias (SSC). Tejido testicular xenoinjerto reproduce desarrollo de los testículos y la espermatogénesis de las especies de los distintos donantes en los ratones receptores.

Abstract

El transplante de células germinales fue desarrollado por el Dr. Ralph Brinster y sus colegas de la Universidad de Pennsylvania en 1994 ^1,2. Estos estudios innovadores mostraron que la microinyección de células germinales de los ratones donantes fértiles en los túbulos seminíferos de ratones infértiles receptores de donantes en los resultados derivados de la espermatogénesis y la producción de esperma por parte del animal receptor ^2. El uso de machos donantes que transporten la bacteriana β-galactosidasa la identificación de genes permitido de donante-deriva la espermatogénesis y la transmisión de la haplotipo donante a la descendencia por ¹ los animales receptores. Sorprendentemente, después de un trasplante en el lumen de los túbulos seminíferos, las células germinales trasplantados fueron capaces de pasar del compartimento luminal de la membrana basal, donde se encuentran las espermatogonias ^3. En general se acepta que las ESC sólo son capaces de colonizar el nicho y la espermatogénesis volver a establecerse en los testículos receptores. Por lo tanto, de células germinalesel trasplante ofrece un enfoque funcional para estudiar el nicho de células madre en los testículos y caracterizar supuestas células madre de espermatogonias. Hasta la fecha, el trasplante de células germinales se utiliza para dilucidar la biología básica de células madre, para producir animales transgénicos a través de la manipulación genética de células germinales antes del trasplante ^4,5, para estudiar células de Sertoli-germen de interacción celular ^6,7, SSC homing y la colonización ^{3, 8,} así como la CSE auto-renovación y diferenciación ^9,10.

El trasplante de células germinales es también factible en especies de gran tamaño ^11. En éstas, las principales aplicaciones son la preservación de la fertilidad, la difusión de la genética de élite en las poblaciones animales, y la generación de animales transgénicos como el estudio de la espermatogénesis y la biología de piel a piel con esta técnica es logísticamente más difícil y caro que en los roedores. El trasplante de células germinales de especies de gran tamaño en los túbulos seminíferos de ratones resulta en colonizatde iones de las células del donante y la expansión espermatogonias, pero no en su diferenciación completa presumiblemente debido a la incompatibilidad del compartimiento célula receptora somática con las células germinales de especies filogenéticamente distantes ^12. Un enfoque alternativo es el trasplante de las células germinales de especies de gran tamaño, junto con su entorno compartimento somática. Estamos por primera vez en 2002, que pequeños fragmentos de tejido testicular de los machos inmaduros trasplantadas bajo la piel dorsal de ratones inmunodeficientes son capaces de sobrevivir y tener un desarrollo completo con la producción de esperma fertilización competente ^13. Desde entonces, tejido testicular xenoinjerto se ha demostrado para tener éxito en muchas especies y ha surgido como una alternativa valiosa para estudiar el desarrollo testicular y la espermatogénesis de los animales grandes en ratones ^14.

Protocol

PARTE A. El transplante de células germinales en ratones 1. Preparación de los ratones receptores Los beneficiarios deben ser inmunológicamente tolerantes (ya sea genéticamente compatible a los donantes o inmunológico deficiente) a las células del donante de testículo. Los beneficiarios deben ser, naturalmente, carece de la espermatogénesis (por ejemplo, W / v ratones) o de agotamiento de las células germinales endógenos. El agotamiento de cé…

Discussion

1. El transplante de células germinales

Germen de trasplante de células proporciona el ensayo sólo funcional para la confirmación inequívoca de la presencia de células madre de espermatogonias (SSC) en una población celular. SSC Sólo en casa pueden y colonizar el nicho de cooperación Sur-Sur en la membrana basal e iniciar los donantes derivado de la espermatogénesis. El transplante de células germinales ha permitido estudiar y manipular las ESC de una manera sin precedentes. La téc…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
Collagenase (type IV)	Sigma	C5138
Trypsin-EDTA	Invitrogen	25200-056
DNaseI	Sigma	DN25
DMEM	Invitrogen	31053-028
Trypan blue stain	Invitrogen	15250-061
Nylon mesh cell strainer	BD biosciences	352340 (40μm) 352350 (70μm)
Busulfan	Sigma	B2635
Thin-Wall Glass Capillaries	World Precision Instrument	TW 100-3
BD intramedic plyethylene tubing (PE100)	BD	CA-63018-725
Ethicon 6-0 Silk Suture	Ethicon	706G
Wound clips	BD	427631
Sigmacote	Sigma	SL2
X-gal	Sigma	B4252
Potassium Ferrocyanide	Sigma	P9387
Potassium Ferricyanide	Sigma	P3667
magnesium chloride	Sigma	208337
sodium deoxycholate	Sigma	D6750
N,N-Dimethylformamide	Sigma	D4551
Igepal CA-630	Sigma	18896