Germ Cell Transplantation og testis Tissue Xenografting i Mus

Summary

Protokoller for bakterie celle transplantasjon og testis vev xenografting er beskrevet. Bakterie celle transplantasjon resultater i donor-derived spermatogenesen i mottakerlandene testikler og representerer en funksjonell rekonstituering analysen for identifisering av spermatogonial stamceller (SSCs). Testikkel vev xenografting reproduserer testis utvikling og spermatogenesen av ulike donor arter i mottakerlandene mus.

Abstract

Bakterie celle transplantasjon ble utviklet av Dr. Ralph Brinster og kolleger ved University of Pennsylvania i 1994 ^1,2. Disse banebrytende studier viste at mikroinjeksjon av kjønnsceller fra fruktbare donor mus inn i sædproduserende tubuli av infertile mottakerlandenes mus resulterer i donor-avledet spermatogenesen og sperm produksjon av mottakeren dyret ^to. Bruken av donor menn bærer bakteriell β-galaktosidase genet tillatt identifisering av donor-avledet spermatogenesen og overføring av donor haplotype til avkommet etter mottakerland dyr ^1. Overraskende, etter transplantasjon inn i lumen av seminiferous tubuli, var transplanterte kjønnsceller kunne bevege seg fra luminal rommet til basalmembran hvor spermatogonier ligger ^tre. Det er generelt akseptert at bare SSCs er i stand til å kolonisere nisje og reetablere spermatogenesen i mottakerlandene testis. Derfor bakterie celletransplantasjon gir en funksjonell tilnærming for å studere stamcelleforskningen nisje i testis og å karakterisere antatte spermatogonial stamceller. Til dags dato er bakterie celle transplantasjon brukes til å belyse grunnleggende stamcelleforskningen biologi, for å produsere transgene dyr gjennom genetisk manipulering av kjønnsceller før transplantasjon ^4,5, for å studere sertoli celle-bakterie celle interaksjon ^6,7, SSC homing og kolonisering ^{3, 8,} samt SSC selvfornyelse og differensiering ^9,10.

Bakterie celle transplantasjon er også mulig i store arter ^11. I disse de viktigste programmene er bevaring av fruktbarhet, formidling av elite genetikk i dyrepopulasjoner, og generering av transgene dyr som studiet av spermatogenesen og SSC biologi med denne teknikken er logistikkmessig vanskeligere og dyrere enn hos gnagere. Transplantasjon av kjønnsceller fra store arter i de seminiferøse tubuli av mus resulterer i colonization av donor cellene og spermatogonial ekspansjon, men ikke i sin fulle differensiering antakelig på grunn av inkompatibilitet av mottakeren somatiske kupé med kjønnsceller fra fylogenetisk fjerne arter ^12. En alternativ tilnærming er transplantasjon av kjønnsceller fra store arter sammen med sine omkringliggende somatisk avdeling. Vi først rapportert i 2002, at små fragmenter av testikkel vev fra umodne hanner transplantert under dorsal huden av immunsvikt mus er i stand til å overleve og gjennomgå full utvikling med produksjon av befruktning kompetent sperm ^13. Siden da testikkel vev xenografting har vist seg å være vellykket i mange arter, og dukket opp som et verdifullt alternativ til å studere testis utvikling og spermatogenesen av store dyr i mus ^14.

Protocol

DEL A. Germ celle transplantasjon i mus 1. Utarbeidelse av mottaker mus Mottakere skal være immunologisk tolerant (enten genetisk tilpasset givere eller immun-mangelfull) til donor testis cellene. Mottakere skal være enten naturlig blottet for spermatogenesen (f.eks w / w v mus) eller utarmet av endogene kjønnsceller. Bakterie celle uttømming kan oppnås ved bestråling eller cellegifter som busulfan. I denne protokollen, beskriver vi metoden for å…

Discussion

1. Bakterie celle transplantasjon

Bakterie celle transplantasjon gir den eneste funksjonelle analysen for utvetydig bekreftelse av tilstedeværelse av spermatogonial stamceller (SSCs) i en celle befolkning. Bare SSCs kan hjem til og kolonisere SSC nisje på basalmembran og initiere donor-derived spermatogenesen. Bakterie celle transplantasjon gjorde det mulig å studere og manipulere SSCs på en enestående måte. Teknikken har blitt brukt til å produsere transgene dyr gjennom genetisk manipu…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
Collagenase (type IV)	Sigma	C5138
Trypsin-EDTA	Invitrogen	25200-056
DNaseI	Sigma	DN25
DMEM	Invitrogen	31053-028
Trypan blue stain	Invitrogen	15250-061
Nylon mesh cell strainer	BD biosciences	352340 (40μm) 352350 (70μm)
Busulfan	Sigma	B2635
Thin-Wall Glass Capillaries	World Precision Instrument	TW 100-3
BD intramedic plyethylene tubing (PE100)	BD	CA-63018-725
Ethicon 6-0 Silk Suture	Ethicon	706G
Wound clips	BD	427631
Sigmacote	Sigma	SL2
X-gal	Sigma	B4252
Potassium Ferrocyanide	Sigma	P9387
Potassium Ferricyanide	Sigma	P3667
magnesium chloride	Sigma	208337
sodium deoxycholate	Sigma	D6750
N,N-Dimethylformamide	Sigma	D4551
Igepal CA-630	Sigma	18896