Summary
De procedure toont de methodologie van magnetische resonantie elastografie voor de controle op de gemanipuleerde uitkomst van vet-en osteogene weefselmanipulatieproduct constructies door middel van niet-invasieve lokale evaluatie van de mechanische eigenschappen met behulp van microscopische magnetische resonantie elastografie (μMRE).
Abstract
Traditionele mechanische testen resulteert vaak in de vernietiging van het monster, en in het geval van lange termijn weefselmanipulatieproducten bouwen studies, het gebruik van destructieve evaluatie is niet aanvaardbaar. Een voorgestelde alternatief is het gebruik van een afbeeldend proces dat magnetische resonantie elastografie. Elastografie is een niet-destructieve methode voor het bepalen van de gemanipuleerde uitkomst door het meten van lokale mechanische waarde van onroerend goed (dat wil zeggen, complexe shear modulus), die essentieel zijn markers voor het identificeren van de structuur en de functionaliteit van een weefsel. Als een niet-invasieve middelen voor de evaluatie, is het toezicht van gemanipuleerde constructen met beeldvormende technieken zoals magnetische resonantie beeldvorming (MRI) gezien steeds meer interesse in het afgelopen decennium 1. Zo hebben de magnetische resonantie (MR) technieken voor de verspreiding en relaxometrie in staat geweest om de veranderingen in de chemische en fysische eigenschappen karakteriseren tijdens engineered tissue ontwikkeling 2. De methode voorgesteldde volgende protocol gebruikt microscopische magnetische resonantie elastografie (μMRE) als een niet-invasieve MR gebaseerde techniek voor het meten van de mechanische eigenschappen van kleine zachte weefsels 3. MRE wordt bereikt door het koppelen van een sonische mechanische aandrijving met het weefsel van de rente en het opnemen van de shear wave voortplanting met een MR-scanner 4. Onlangs heeft μMRE toegepast in tissue engineering tot essentiële groei informatie die traditioneel wordt gemeten met behulp van destructieve mechanische macroscopische technieken 5 te verwerven. In de volgende procedure wordt elastografie bereikt door het afbeelden van kunstmatige constructen met een gemodificeerde Hahn spin-echo sequentie gekoppeld met een mechanische aandrijving. Zoals getoond in figuur 1, de gemodificeerde sequentie gesynchroniseerd beeldopname met de overdracht van externe shear golven vervolgens de beweging gesensibiliseerd door middel van oscillerende bipolaire paren. Na verzameling van beelden met positieve en negatieve beweging sensitizaTIE, complexe verdeling van de gegevens produceren een shear wave beeld. Vervolgens wordt het beeld geëvalueerd met behulp van een inversie algoritme een dwarskracht stijfheid kaart 6 genereren. De verkregen metingen bij elke voxel is gebleken sterk (R2> 0,9914) correleren met gegevens verzameld dynamische mechanische analyse 7. In deze studie wordt elastografie geïntegreerd in het weefsel ontwikkelproces controle humane mesenchymale stamcellen (h MSC) differentiatie in adipogenic en osteogene constructen zoals getoond in figuur 2.
Protocol
1. Tissue Construct Voorbereiding
Het weefsel te bouwen voorbereiding bestaat uit drie fasen: uitbreiding van de celpopulatie, zaaien van cellen op een biomateriaal schavot, en differentiatie door het gebruik van chemische signaalmoleculen. De procedure voor de voorbereiding constructie is gebaseerd op de methoden onder leiding van Dennis et al.., Hong et al.., En Marion en Mao 8,9,10.
- Na cultuur en uitbreiding van de cellijn zaad humane mesenchymale stamcellen (h MSC) op een gelatine spons (4 mm, 3,5 mm dik) bij een dichtheid van 1x10 cellen 6 / ml van bot en 3x10 6 cellen / ml voor vet-formatie.
- Voor differentiatie van MSC h in vet, toepassen vet inductie media bestaande uit een uM dexamethason, 0,5 pM isobutyl-methylxanthine, 10 ug / ml menselijk recombinant-insuline en 200 pM indomethacine in celexpansie mediumeen keer cellen blijken samenvloeiing op het schavot. Na drie dagen vervangen media met 10 ug / ml menselijk recombinant-insuline groei media 24 uur dan terug naar inductie media. Herhaal de cyclus drie keer en dan nog slechts uit te wisselen in het onderhoud media om de twee dagen.
- Om osteogenesis induceren bereiden osteogene inductie media door een eindconcentratie van 0,1 uM dexamethason, 50 uM van L-ascorbinezuur-2phosphate en 10 mM β-glycerofosfaat in celexpansie medium. Vervang de verse osteogene media om de twee dagen.
2. Actuator Karakterisering
Karakterisering van de aandrijving is een cruciale stap voor de MRE experiment. MRE zich op de propagatie van mechanische afschuiving golven beoordeelt lokale waarden van mechanische eigenschappen, en daarom deze mechanische trillingen moeten worden gemaakt en gekarakteriseerd in het weefsel van belang met een piezo-elektrische aktuator. Een geïllustreerde EXAmple van de karakterisering wordt weergegeven in figuur 3. Het doel van deze procedure is om de beweging van de actuator te optimaliseren met het oog op onschadelijke shear golven met een significante amplitudes (~ 250 micron) te genereren.
- Voorafgaand aan het experiment toepassing 0,5% agarose gel de construct in een 10 mm reageerbuis omsluiten. De temperatuur van de gel moet ongeveer 37 ° C om schade aan het construct te minimaliseren.
- Nadat men de agarosegel vijf minuten op kamertemperatuur, steekt het uiteinde van de piëzo-elektrische motor buigen in het oppervlak van de gel.
- Bevestig de buis met het monster en de aandrijving op een stijve steun, en richt de straal van de laser Doppler vibrometer richting de punt van de mechanische aandrijving. De positionering van het systeem het gereflecteerde signaal optimaliseren, gebruikt reflectieband indien nodig.
- Op basis van de verwachte resonantiefrequentie van de mechanische aandrijving, zet u de functie generator om de d vegenesired frequentiebereik (dwz 20 tot 2000 Hz in dit experiment) met behulp van een bedrijfsspanning van 20 Vpp met een witte ruis signaal.
- Bekijken kenmerk spectrum op Polytec Vibrosoft programma de resonantiefrequentie van de te identificeren en het programma op FFT en snelheid als de y-as.
- Voor de verplaatsing meten, stelt u de actuator om een continue sinusoïde op de aangegeven resonantie frequentie met een spanning van 200 Vpp te leveren, en noteer de gegenereerde verplaatsing wordt geleverd aan het oppervlak van de gel. Stel Vibrosoft de FFT weergegeven met verplaatsing als de y-as.
3. Image Acquisition
- Na actuator karakterisering plaats het monster en actuator in het midden van de MRI-scanner. Voor weefsel constructie experimenten, gebruik dan een klein en meer gevoelige RF spoel (dat wil zeggen 10 mm in dit experiment) voor de transmissie en ontvangst van het RF-signaal. (Zie de procedure wordt een 9,4 Tverticale boring magneet voorzien van een triple-as gradiënten, 100 G / cm).
- Schaf een scout beeld voor de identificatie van het construct locatie.
- Stel de parameters voor de overname. Een typische in vitro sagittale scan een herhalingstijd van 1000 ms, echotijd van 20-40 ms, plakdikte van 0,5-1,0 mm en beeldveld van 12x10 mm 2 met een matrix grootte van 128x128 pixels.
- Voor de elastografie parameters, stelt u de actuator de frequentie van de waarde bepaald door de Laser Doppler Vibrometer karakterisering. In de huidige studie werd een bipolaire paar nodig met een gradiënt amplitude van 50 g / cm. Andere parameters aan te passen onder meer de vertraging die moet worden ingesteld op nul milliseconden voor de eerste overname.
- Wijzigen functie generator mode barsten en de parameters van de funktiegenerator aan te passen aan die van de elastografie verkrijging parameters zoals de frequentie en het aantal cycli passen. Ook stelt u de functieTIE generator extern worden geactiveerd.
- Voor een sagittale beeld, stelt de motie sensibilisatie te zijn in de positieve richting slice en start de scan. Na de overname, controleer dan het beeld en verander de gevoeligheid voor de negatieve slice richting.
- Voer de MATLAB-programma dat de ingewikkelde verdeling zal presteren voor het genereren van de shear wave afbeelding.
- Beoordeel de afbeelding voor de aanwezigheid van afschuiving golven en mogelijke artefacten zoals fase-verpakking.
- Als er geen aanpassingen van de afbeelding zijn nodig aan te passen parameter array size tot acht gelijke afstand van elkaar waarden tussen nul seconden tot een volledige periode van de gekarakteriseerd resonantiefrequentie.
- Het verwerven van een scan in zowel de positieve als negatieve slice oriëntaties.
- Nadat de beelden werden aangemaakt, gebruik dan een MATLAB programma dat is ontworpen voor het genereren van de shear wave data uit een array van beelden.
4. MRE Experiment Beeldverwerking
- The laatste stap van MRE is het berekenen van de schuifspanning stijfheid van de afschuifgolf beelden. Het plaatsen van de gegevens in de MATLAB-programma dat de drie-dimensionale dataset (2 ruimtelijke, 1 tijdelijke) zal beoordelen.
Let op: Door het aannemen van een vlakke shear wave, de vergelijkingen van de beweging los te koppelen waardoor de schatting van de complex-waarde afschuifmodulus als functie van de verplaatsing en de Laplace. Het algoritme benadert ruimtelijke tweede derivaten met eindige verschillen en berekent de afschuifmodulus een pixel voor pixel basis. Vanuit dit complex getal, kunnen veel mechanische parameters worden afgeleid, zoals de shear wave snelheid, golf demping, shear stijfheid, shear elasticiteit, shear viscositeit, etc. Het algoritme maakt het ook mogelijk de selectie van regio's van belang zijn voor de gemiddelde en de standaarddeviatie van de elke parameter wordt berekend.
- De afbeeldingsparameters moeten de bij het begin van het programma. Bovendien the bovengrens van de elastogram kan worden aangepast aan een optimaal contrast in het monster.
Opmerking: Het programma biedt tussentijdse resultaten (de ene na de low-pass filters, golf na directional filtering, tijdelijke FFT-, lijn-profielen, enz.) die de gebruiker helpen een schatting van de getrouwheid van het herstel.
- Sommige parameters kunnen worden aangepast op basis van deze informatie, zoals het niveau van de low-pass filters, de temporele frequentie van de beweging, de richting van voortplanting van de golf, etc. De standaarddeviatie van een parameter in een bepaalde regio van belang is een indicator van de kwaliteit van de berekening.
5. Representatieve resultaten
Figuur 4 wijst op de verandering in de mechanische eigenschappen gedurende vier weken van de osteogene en adipogenic construct ontwikkeling. MRE is uitgevoerd op 730 tot 820 Hz. Beide geplaatste sponzen gestart ongeveer 3 kPa, osteogenic gerichte weefsels geresulteerd in een stijfheid van 22 kPa; dat vet gericht weefsels daalde in stijfheid tot en met 1 kPa. Bovendien is de osteogene constructies vertoonden een opmerkelijke daling van de omvang in vergelijking van begin tot eind van de studie. Extra eigenschappen uit elastografie onderzoek worden weergegeven in tabel 1.
Figuur 1. Het beeld acquisitieproces voor magnetische resonantie elastografie. Tijdens beeldopname een pulssequentie (a) bepaalt de synchronisatie (b) van de funktiegenerator aan de bipolaire pulsen gradiënten van de MRI-scanner. Na de overname van een bipolaire gradiënten geschakeld in positieve en negatieve oriëntaties, (c) een shear wave beeld wordt geproduceerd met behulp van complexe divisie.
Figuur 2. Stroomdiagram van het MRE proces weefsel motorEred constructen. Eerst worden cellen (a), eerste gegroeid en uitgebreid tot de grootte van de populatie van essentieel belang voor het ontworpen project. De cellen worden uitgezaaid (b) op een biomateriaal steiger en chemische reagentia toegepast voor differentiatie signaal. Steigers gekenmerkt door MRE, waarvan de eerste stap (c) het bepalen van de resonantiefrequentie van de aandrijving is gekoppeld met de construct. Vervolgens MRI beeld (d) worden verkregen met een dwarskracht golf beeld (e) het genereren. Tenslotte wordt een algoritme toegevoerd aan een elastogram opbrengst (f) brengt de stijfheid van de constructie. Tegelijkertijd constructies zijn coupes voor histologische beoordeling (g) om differentiatie te valideren.
Figuur 3. Actuator karakterisering procedure. De gelatine steiger wordt omsloten door een 0,5% agarosegel. Om de beweging die wordt overgebracht in de steekproef karakteriseren van een witte ruis wordt eerst gestuurd in het systeem(1a) en de daaruit voortvloeiende beweging wordt gedetecteerd met behulp van een laser Doppler vibrometer (1b). Zodra de resonantiefrequentie wordt bepaald, een continue sinus signaal resonantie (2a) aan de verplaatsing (2b) naar de omgeving gelatine bepalen.
Figuur 4. Construct ontwikkeling map over periode van vier weken. Adipogenic (A) en osteogene (O) constructen wordt van links naar rechts met overeenkomstige grootte en afschuifgolf beelden elastogram en gemiddelde schuifspanning stijfheid. De kleurenkaart voor de elastogram komt overeen met het kleurenschema van het staafdiagram en opstaan balken geven de standaardafwijking binnen regio elk construct van belang.
Tabel 1. Mechanische eigenschappen van vet-en osteo constructies over een periode van vier weken van groei.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In deze procedure wordt het proces van MRE voor weefselmanipulatieproducten constructies laten zien van cel voorbereiding tot het genereren van een elastogram. Door een destructieve mechanische beoordelingsmethode de tissue engineering leiding is het nu mogelijk om veranderingen in technische constructen evalueren in verschillende stadia van ontwikkeling. Daarnaast MRE een aanvulling op andere MR methoden voor ontwikkeld controle weefsel construeert, zoals verspreiding, magnetisatie overdracht en chemische verschuiving analyse 1.
Bij het uitvoeren MRE experimenten moet een aantal beperkingen worden opgemerkt. De beoordeling van in vitro exemplaren is een tijd gevoelig studie. Daarom wordt aanbevolen dat de studies mag niet meer dan een uur duren, zodat eventuele schade aan het weefsel construct wordt geminimaliseerd. Daarnaast kunnen trouwe herstel van de stijfheid kaart te wijten aan constructies die ofwel te klein of stijf 6 worden aangetast. Ope mogelijke oplossing voor dit probleem met hogere frequentie (> 2,5 kHz) en de golflengte omgekeerd evenredig met de frequentie. Piëzo-elektrische actuatoren stapel gedreven door de hoge voltage versterkers zijn in staat om voldoende beweging te leveren op deze frequenties om een volledige afschuiving golflengte in het monster te produceren. Een andere mogelijke wijziging van het protocol is het gebruik van sneller sequenties zoals fast spin-echo en echo planar imaging 11, 12.
Naast de mogelijkheden van MRE voor weefselmanipulatieproducten constructies in vitro, de volgende stap van pre-klinische evaluatie is voor de ontwikkeling van geïmplanteerde weefsels te evalueren in een levend systeem. De toepassing van MRE voor muis-studies zou een andere mogelijkheid om niet-destructief evalueren van de ontwikkeling van het weefsel constructen. Uitbreiding van elastografie voor de behandeling van bot of kraakbeen defecten zou mogelijk tot een beter begrip van hoe langer durende functionele implantaten f producerenof gebruik in de regeneratieve geneeskunde. Magnetische resonantie elastografie heeft het potentieel om een steeds grotere rol spelen in de validatie van gemanipuleerde constructies zowel in vitro als in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten bekend te maken.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd mede ondersteund door de NIH RO3-EB007299-02 en NSF EPSCoR First Award.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| MSCGM-Bullet Kit | Reagent | Lonza Inc. | PT-3001 | Store at 4°C |
| 1X DPBS | Reagent | Invitrogen | 21600-010 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25300-054 | Store at -20°C |
| Dexamethasone | Reagent | Sigma-Aldrich | D2915 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Reagent | Sigma-Aldrich | I5879 | Store at -20°C |
| Insulin-bovine pancreas | Reagent | Sigma-Aldrich | I6634 | Store at -20°C |
| Indomethacin | Reagent | Sigma-Aldrich | I7378 | |
| Β-Glycerophosphate | Reagent | Sigma-Aldrich | G9891 | |
| L-Ascorbic Acid 2-phosphate | Reagent | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| Gelfoam | Scaffold | Pharmacia Corporation (Pfizer) | 09-0315-08 | |
| Human mesenchymal stem cells | Cell Line | Lonza Inc. | PT-2501 | |
| 9.4T MR Scanner | Equipment | Agilent Technologies | 400MHz WB | |
| 10mm Litz Coil | Equipment | Doty Scientific | ||
| Laser Doppler Vibrometer | Equipment | Polytec | PDV-100 | |
| Vibrosoft (20) | Software | Polytec | ||
| Function generator | Equipment | Agilent Technologies | AFG 3022B | |
| Amplifier | Equipment | Piezo Inc. | EPA-104-115 | |
| Piezo Bending motor | Equipment | Piezo Inc. | T234-A4Cl-203X | |
| Computer-Linux | Equipment | Intel | Processor: Intel Core 2 Duo E8400, Memory: 2G | |
| Computer-Windows | Equipment | Intel | Processor: Intel Core 2 Duo E8400, Memory: 2G | |
| MATLAB | Software | Mathworks | 2009b |
References
- Xu, H., Othman, S. F., Magin, R. L. Monitoring tissue engineering using magnetic resonance imaging. J. Biosci. Bioeng. 106, 515-527 (2008).
- Xu, H., Othman, S. F., Hong, L., Peptan, I. A., Magin, R. L. Magnetic resonance microscopy for monitoring osteogenesis in tissue-engineered construct in vitro. Phys. Med. Biol. 51, 719-732 (2006).
- Othman, S. F., Xu, H., Royston, T. J., Magin, R. L. Microscopic magnetic resonance elastography (microMRE. Magn. Reson. Med. 54, 605-615 (2005).
- Muthupillai, R., Lomas, D. J., Rossman, P. J., Greenleaf, J. F., Manduca, A., Ehman, R. L. Magnetic resonance elastography by direct visualization of propagating acoustic strain waves. Science. 269, 1854-1857 (1995).
- Othman, S. F., Curtis, E. T., Plautz, S. A., Pannier, A. P., Xu, H. Magnetic resonance elastography monitoring of tissue engineered constructs. NMR Biomed. , Forthcoming (2011).
- Oliphant, T. E., Manduca, A., Ehman, R. L., Greenleaf, J. F. Complex-valued stiffness reconstruction for magnetic resonance elastography by algebraic inversion of the differential equation. Magn. Reson. Med. 45, 299-310 (2001).
- Ringleb, S. I., Chen, Q., Lake, D. S., Manduca, A., Ehman, R. L., An, K. Quantitative shear wave: comparison to a dynamic shear material test. Magn. Reson. Med. 53, 1197-1201 (2005).
- Hong, L., Peptan, I., Clark, P., Mao, J. J. Ex vivo adipose tissue engineering by human marrow stromal cell seeded gelatin sponge. Ann. Biomed. Eng. 33, 511-517 (2005).
- Dennis, J. E., Haynesworth, S. E., Young, R. G., Caplan, A. I. Osteogenesis in marrow-derived mesenchymal cell porous ceramic composites transplanted subcutaneously: effect of fibronectin and laminin on cell retention and rate of osteogenic expression. Cell Transplant. 1, 23-32 (1992).
- Marion, N. W., Mao, J. J. Mesenchymal stem cells and tissue engineering. Methods Enzymol. 420, 339-361 (2006).
- Rydberg, J., Grimm, R., Kruse, S., Felmlee, J., McCracken, P., Ehman, R. L. Fast spin-echo magnetic resonance elastography of the brain. Proceedings of the International Society of Magnetic Resonance in Medicine, Glasgow, Scotland, , 1647-1647 (2001).
- Kruse, S. A., Grim, R. C., Lake, D. S., Manduca, A., Ehman, R. L. Fast EPI based 3D MR elastography of the brain. Proceedings of the International Society for Magnetic Resonance in Medicine, Seattle, Washington, , 3385-3385 (2006).
